脊髓损伤（SCI）是一种高致残性的中枢神经系统创伤性疾病，不仅导致运动感觉功能障碍，还常引发严重的肠道并发症^[1]。SCI急性期，原发性机械损伤会引发一系列的继发性炎症联级反应，SCI后释放大量促炎因子，形成的“炎症风暴”被认为是加剧神经组织损伤和全身并发症的重要因素^[2-3]。

赵丽萍等^[4]研究发现，斑马鱼SCI后肠道炎症因子基因表达水平升高，肠道屏障遭到破坏，证明了SCI可以引起斑马鱼的肠道炎症。NOD样受体蛋白3（NLRP3）在SCI后显著表达，可以促进促炎细胞因子白介素1β（IL-1β）和白介素18（IL-18）的生成，引发炎症级联反应^[5]。核因子-κB（NF-κB）作为炎症反应的关键转录因子，同时也是NLRP3表达的核心调控因子，NF-κB通路的过度激活，可以下调闭合蛋白（Claudin-1）和带状闭合蛋白-1（ZO-1），破坏肠道屏障的完整性，抑制NF-κB/NLRP3通路可以抑制半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）的激活和IL-1β等促炎因子的产生，且可以修复肠道屏障功能^[6-7]。笔者团队在前期研究中发现^[8-9]，临床中使用通督调神灸可以有效恢复脊髓损伤患者的运动功能与胃肠道功能，但具体作用机制不明。通督调神灸是以全国名老中医张道宗教授的“通督调神”理论为核心发展而来，通督调神灸可以刺激督脉以及相关穴位，督脉为“阳脉之海”，总督一身之阳气，可以起到调神醒脑、振奋阳气的作用，进而调节气血运行与脏腑功能等^[10]。郭杨等^[11]发现，通过艾灸督脉穴位与命门穴可以观察到，督脉穴与命门穴的皮肤血流微循环灌注量明显高于周边部位皮肤，为经穴的特异性提供新的依据。且艾灸作为传统中医外治疗法，其通过温热刺激特定穴位调节机体免疫功能的作用在多种炎症性疾病中得到验证，如在肠黏膜炎大鼠模型中，艾灸关元、天枢、神阙等穴可以降低NLRP3、Caspase-1及相关炎症因子的表达，缓解炎症损伤^[12]。但通督调神灸是否可以调控NF-κB/NLRP3通路对脊髓损伤后的肠道炎症产生影响，尚未见有报道。

因此，本研究拟建立脊髓损伤大鼠模型，通过观察通督调神灸对脊髓损伤大鼠肠道炎症的影响，探究通督调神灸通过调控NF-κB/NLRP3炎症小体通路治疗脊髓损伤后肠道炎症的可能机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物与分组

使用45只SD雄性大鼠，健康状态均良好，体质量为250~280 g，购于河南斯克贝斯生物科技股份有限公司[SPF级，许可证号：SCXK（豫）2020-0005]。动物饲养于安徽中医药大学实验动物房，室温20~24 ℃，相对湿度45%~55%，明暗12 h交替，每笼3只，自由进食饮水，每日更换垫料。按随机数表法将45只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、艾灸组，每组各15只。实验获得安徽中医药大学动物伦理委员会批准（批准编号：AHUCM-rats-2024086）。

1.2 主要试剂及仪器

NF-κB p65抗体（Affinity，货号：BF8005）；β - actin抗体（proteintech，货号：66009-1-Ig）；CC趋化因子配体2（CCL2）抗体（proteintech，货号：26161-1-AP）；Ahr抗体（proteintech，货号：67785-1-Ig）；Claudin-1抗体（proteintech，货号：28674 - 1 - AP）；ZO-1抗体（proteintech，货号：21773-1-AP）；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（中杉金桥，货号：ZB-2305）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥，货号ZB-2301）；大鼠白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附检测试剂盒（武汉科鹿生物公司，货号ELK1158、ELK1396）；TRI Reagent试剂（Biosharp，货号：BS258A）；Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂（YEASEN，货号：11121ES60）；SYBR Green qPCR Mix试剂（Biosharp，货号：BL697A）。

常温/冷冻离心机（型号：CF1524R，SCILOGEX）；高速组织研磨仪（型号：KZ-Ⅱ，武汉赛维尔）；超微量分光光度计（型号：T51491，IMPLEN）；Real-time PCR仪（型号：LightCycler 480，罗氏）；旋涡混合器（型号：XH-C，新宝仪器）；台式高速冷冻离心机（型号：H1650R，上海卢湘仪）；凝胶成像仪（型号：ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD公司）；台式低速离心机（型号：TDZ6B-WS，上海卢湘仪）；电泳系统（型号：Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司）；化学发光成像系统（型号：SH-523，杭州申花科技有限公司）；高速组织研磨仪（型号：KZ-Ⅱ，武汉赛维尔公司）；酶标仪（型号：DR-200Bc，无锡华卫德朗）。

1.3 实验方法 1.3.1 脊髓损伤模型的制备

采用改良Allen’s垂直打击法^[13]建立大鼠胸（T）10节段脊髓损伤模型，禁食24 h后，腹腔注射2% 戊巴比妥钠（给药体积为2mL/kg）麻醉大鼠，以达到无眼睑反射状态。清洁暴露T8-T12椎体附近皮肤，沿中线切3~4 mm，钝性分离背部肌肉组织，暴露出椎体后用咬骨钳咬除大鼠T9-T10棘突及全部椎板，充分暴露该段脊髓，准备质量为10 g的克氏针，带有刻度的导管，1 mm厚的塑料垫片，导管用于导引克氏针精确撞击，垫片贴附于脊髓表面，确保撞击受力均匀，使用装置前，将导管调整与地面垂直，置于垫片正上方2 mm处，克氏针沿着导管从6 cm的固定高度垂直自由下落撞击垫片损伤脊髓，并停留5 s，在撞击脊髓的瞬间，大鼠双下肢强直抽搐，尾巴僵硬翘起，被打击处脊髓表面充血、水肿或出血（见图 1）。假手术组：仅咬除T9~T10棘突及椎板，暴露脊髓但不接受撞击。术后逐层缝合伤口，术后3 d内每日对大鼠进行抗感染处理，术后人工按摩脊髓损伤大鼠腹部辅助排尿，每天2次，直至大鼠可自行排尿为止。

1.3.2 实验动物纳入标准

待动物在麻醉完全清醒后，使用脊髓损伤行为学评分Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）运动功能量表^[14]对SCI大鼠模型进行评分，0分为完全瘫痪，21分为满分说明肢体运动功能完全正常，分值越高，表明大鼠肢体运动功能越好。由两名与本实验无关人员对大鼠进行评分，令每只大鼠在旷场自由行动，观察其四肢运动情况，每只观察2 min，并记录分数。进行造模后的大鼠评分为0~2分，说明造模成功，则可纳入实验；假手术组大鼠评分为21分，说明运动功能正常，则可纳入实验。若不符合以上标准应剔除。

1.3.3 治疗干预方法

依据“通督调神灸”理论核心及“督脉通于脑而络于肠”的中医经络理论进行选穴干预，选取“百会”“大椎”“命门”3个穴位作为主穴进行悬灸，穴位定位按照中国针灸学会制定的《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》^[15]选取，并在3个穴位进行剃毛标记。自术后第1天起，使用细艾条（尺寸：0.6 cm×20 cm）对艾灸组大鼠的3个穴位进行悬灸，每个穴位悬灸20 min，每日1次，连续艾灸14 d，温度控制在45~50 ℃，艾灸时艾条应距离大鼠皮肤3 cm左右。假手术组与模型组除了进行正常术后护理与饲养外，不进行其他干预方法。

1.3.4 取材

3组大鼠经过连续14 d的干预后，进行结肠组织取材。腹腔注射质量浓度2% 戊巴比妥钠（给药体积为2 mL/kg），碘伏消毒后用剪刀剪开皮肤，用镊子提起剑突，打开胸腔，暴露心脏。注射器针头经左心室流插入升主动脉，用止血钳固定针头。用剪刀剪开右心耳，使静脉血慢慢放出。快速推注200 mL生理盐水，直至肝脏颜色变为黄白色，再用4% 多聚甲醛（0.1 mol/L，pH7.4）持续灌注固定20 min，观察到大鼠躯体变硬，停止灌注。打开腹腔，在距肛门约7 cm处取结肠组织，剪取约2 cm长的结肠组织，并将结肠组织沿正中线剪开平铺，使用生理盐水冲洗干净，再做储存备用。每组随机取5份结肠组织置入多聚甲醛固定液中存放，用于后续苏木精-伊红（HE）染色，每组随机取6份结肠组织放入冻存管，经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于酶联免疫吸实验（ELISA）、蛋白免疫印迹法（Western blot）及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测，每组剩余4份结肠组织作为备用样本。

1.4 检测方法与观察指标 1.4.1 结肠组织HE染色

取多聚甲醛固定的结肠组织，进行常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精染色5 min，流水冲洗返蓝；伊红染色2 min，脱水透明后中性树胶封片。采用光学显微镜观察结肠组织病理形态。

1.4.2 ELISA检测相关炎症因子含量

取结肠组织匀浆液[磷酸盐缓冲溶液（PBS）体积比1∶9]，4 ℃条件下，以12 000 rpm（离心半径8 cm）离心10 min，收集上清。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，加入终止液后，立即使用酶标仪测定450 nm吸光度，根据标准曲线计算TNF-α、IL-6、IL-23、IL-1β、IL-18浓度（pg/mg蛋白）。

1.4.3 Western blot检测相关蛋白表达

取-80 ℃保存的结肠组织，加入RIPA裂解液冰上匀浆，4 ℃条件下，以12 000 rpm（离心半径8 cm）离心10 min，取上清分装于1.5 mL离心管中并置于-70 ℃保存。采用BCA法测定蛋白浓度，调整样本至等浓度后与5× SDS上样缓冲液混合，95 ℃变性5 min。取30 μg蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，湿转法转移至PVDF膜。5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入CCL2（1∶1 000）、NF -κB p65（1∶1 000）、Ahr（1∶5 000）、Claudin-1（1∶3 000）、ZO-1（1∶5 000）及β -actin（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次后，加入HRP标记二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。ECL化学发光显影。

1.4.4 RT-qPCR检测mRNA表达量

使用RT-qPCR法检测NF-κB、NLRP3、Caspase-1的mRNA表达量，采用TRI Reagent提取结肠组织总RNA，按Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，mRNA采用随机引物。qPCR反应体系（20 μL）：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 2 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH₂O 6.4 μL。以β-atin内参为标准化，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表 1。

1.5 统计学分析

实验数据使用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0软件进行统计分析。所有计量资料符合正态分布以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐性采用Levene检验进行验证。若满足方差齐性则采用LSD检验进行两两比较。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 造模术后评分

经过两名评分员鉴定，假手术组大鼠的BBB评分均为满分21分，符合实验标准；模型组每只大鼠的BBB评分均≤2分，表明脊髓损伤模型制备成功，符合实验标准；艾灸组每只大鼠的BBB评分均≤2分，表明脊髓损伤模型制备成功，符合实验标准。模型组与艾灸组术后的BBB评分均远小于假手术组（P < 0.05），差异具有统计学意义，见图 2。

2.2 各组大鼠结肠组织病理形态学比较

假手术组结肠黏膜结构清晰完整，固有层厚度正常，黏膜肌层连续完整，未见明显炎性细胞异常聚集或水肿，结肠组织形态学结构正常；模型组结肠黏膜结构出现缺损，杯状细胞数量减少，固有层增厚，黏膜肌层结构断裂，黏膜下层水肿，可见大量炎性细胞浸润，炎症反应剧烈；艾灸组黏膜结构相较于模型组得到一定改善，细胞排列趋向整齐，变性坏死细胞减少，固有层增厚程度减轻，炎性细胞浸润密度降低，黏膜肌层改善，黏膜下层水肿减轻，提示结肠组织炎症反应减轻，组织损伤得到一定程度的修复。见图 3。

2.3 各组大鼠结肠组织炎症因子含量比较

与假手术组相比，模型组结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-23、IL-1β、IL-18含量水平均显著升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与模型组相比，艾灸组结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-23、IL-1β、IL-18含量水平均显著下降，差异具有统计学意义（P < 0.05）。以上结果说明经过通督调神灸干预后，大鼠结肠组织炎症有效改善。见图 4。

2.4 各组结肠组织NF-κB p65、CCL2、Ahr蛋白表达水平比较

与假手术组相比较，模型组NF-κB p65、CCL2蛋白相对表达水平均显著升高（P < 0.05）；与假手术组相比，模型组中Ahr的蛋白相对表达水平显著降低（P < 0.05）；与模型组相比，艾灸组NF-κB p65、CCL2蛋白相对表达水平均显著低于模型组（P < 0.05）；与模型组相比，艾灸组中Ahr的蛋白相对表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见图 5。

2.5 各组结肠组织紧密连接蛋白表达水平比较

与假手术组相比，模型组的Claudin-1、ZO-1蛋白相对表达水平显著下降（P < 0.05）；与模型组相比，艾灸组的Claudin-1、ZO-1蛋白相对表达水平显著上升，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。

2.6 各组结肠组织NF - κB、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达水平比较

与假手术组相比，模型组NF-κB、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达量显著升高（P < 0.05）；与模型组相比，艾灸组NF-κB、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达量显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见图 7。

3 讨论

脊髓损伤在中医上属于“体堕”“痿症”的范畴，但对于脊髓损伤后出现的肠道炎症尚无定论，督脉受损，阳气亏虚，气血运行不畅是脊髓损伤及其并发症的主要病因。督脉损伤导致阳气不振，气血瘀滞，不仅影响肢体功能，亦使脏腑失于温煦推动，肠道气机壅塞，传导失职，终致肠道炎症与屏障损伤。针灸督脉腧穴治疗肠易激综合征能够实现脑肠轴的双向调节，通过改善胃肠动力及调节肠道菌群等方面减轻患者胃肠道症状，提示了现代“脑-肠轴”环，减轻疼痛，抑制炎症因子的产生。曹钰等^[19]发理论揭示的中枢神经系统与胃肠功能双向调控机现，使用针刺联合督脉灸治疗SCI后肠道功能障碍制，可能与中医“督脉通于脑而络于肠”的理论具有患者疗效显著，明显优于单纯的针刺治疗，初步证相关性^[16-17]。有研究发现^[18]，艾灸可以促进血液循明艾灸督脉对脊髓损伤后的肠道并发症具有一定疗效。通督调神灸法选取“百会”“大椎”“命门”进行艾灸干预治疗。百会穴具有升阳益气、醒脑通窍的功效，艾灸百会穴可以升高大鼠结肠BDNF水平，对肠道菌群产生影响，提示其调节脑肠-轴的潜力^[20]；大椎穴具有治疗脊强反折，调节全身气血的功效，艾灸大椎、足三里穴可以调节骨髓造血干细胞的生长、代谢等^[21]；命门穴可以灸之可温补肾阳，肾阳充足则能温煦脾土，促进运化，艾灸命门穴对炎性反应性肠病等胃肠系疾病具有一定疗效^[22]。三穴协同，共奏“通督脉、调元神、温肾阳”之功，振奋元阳之府，疏通督脊气血，下温肾元以助脾运，促进“脑-肠”互动，改善肠道气血运行状态，为缓解肠道炎症与修复屏障提供内在环境，以上初步说明通督调神灸治疗脊髓损伤后肠道炎症具有一定的可行性。

在炎症性肠病中，NF-κB在炎症启动阶段发挥核心调控功能，Toll受体（TLR4）被激活后，活化IκB激酶（IKK）复合物，磷酸化IκBα，导致其泛素化降解，释放NF-κB p65转入细胞核，启动下游炎症基因的转录^[23-24]。在本研究中，模型组脊髓损伤大鼠结肠组织中NF-κB得到高度表达，其下游炎症因子大量分泌，表明大鼠脊髓损伤后，肠道出现了严重的炎性损伤。有研究发现^[25]，激活TLR4/NF-κB信号通路可以促进NLRP3炎性小体激活以及促炎细胞因子的分泌，NF-κB可以上调NLRP3的表达，促进结肠炎性微环境的形成。在溃结灵治疗结肠炎的研究中发现，经治疗后NF-κB、NLRP3的表达均降低，NLRP3炎症小体的激活可以诱导Caspase-1的活化，促进IL-1β等的产生，进一步激活NF-κB，形成炎症正反馈环路^[26]。根据本实验结果显示，NF-κB的表达水平与NLRP3、Caspase-1的表达呈正相关，该结果与既往研究相一致，经通督调神灸干预后，艾灸组的NF-κB、NLRP3、Caspase-1及炎症因子的表达水平均显著低于模型组，提示通督调神灸可以有效抑制NF-κB/NLRP3通路的活化，减轻脊髓损伤大鼠的肠道炎症反应。

CCL2在免疫细胞招募中具有重要作用，NF-κB与CCL2基因启动子结合，诱导CCL2高表达，CCL2可以招募巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6等促炎因子，放大炎症反应，此外，CCL2还可以通过下调内皮细胞ZO-1等紧密连接蛋白，增加血管通透性，破坏血管屏障^[27-28]。本研究发现，艾灸组中CCL2及促炎因子的显著下调，佐证了通督调神灸可抑制NF-κB的活化，还提示了通督调神灸可能通过刺激紧密连接蛋白的表达来修复肠屏障。AHR是配体激活的转录因子，与信号传导抑制因子2（SOCS2）结合后可以抑制NF-κB信号，通过隔日限食的方式可以激活AHR/SOCS2/NF-κB信号通路，抑制脊髓损伤大鼠后炎症反应^[29]。AHR激活后上调SOCS2表达，阻断TLR4/ MyD88信号传导，抑制NF -κB活化及下游NLRP3炎症小体组装，同时，AHR表达水平显著升高，证实AHR可以抑制NF-κB/ NLRP3通路的活化^[30-31]。以上研究与本实验结果基本一致，提示艾灸可能升高AHR表达水平，抑制NF-κB/ NLRP3轴的信号传导，减轻结肠炎症，不过具体机制还有待进一步验证。有研究显示，槲皮素可通过激活AHR，使紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1表达升高，修复结肠炎小鼠的肠道屏障^[32]。有文献报道，通过艾灸联合针刺治疗克罗恩病患者，可以上调肠上皮紧密连接蛋白ZO - 1、闭合蛋白（Occludin）、Claudin-1的表达，达到修复肠上皮屏障病变与缓解炎症的治疗效果^[33]。艾灸组的结果提示了通督调神灸可能通过升高AHR水平，上调ZO-1和Claudin - 1的表达，从而修复肠屏障与减轻炎症反应。

综上所述，通督调神灸可能通过抑制NF-κB/ NLRP3炎症小体通路的活化，减少促炎因子及趋化因子CCL2的释放，同时上调AHR及紧密连接蛋白（Claudin-1，ZO-1）的表达，达到减轻脊髓损伤后大鼠的肠道炎症反应并修复肠道屏障损伤的疗效。通督调神灸法的作用体现了中医“通督调神、温肾振阳”以调节“脑-肠轴”、改善脏腑功能的治疗思想。此次研究为通督调神灸法提供了分子生物学理论依据，但目前处于初探索阶段仍存在一定的局限性，笔者课题组在未来的实验研究中将会增加特异性工具药干预、单穴的对照组或非穴位艾灸对照组等实验进行更深入的验证。