冠心病（CHD）是由心脏冠状动脉粥样硬化性狭窄或闭塞引起的慢性冠状动脉疾病，以心肌缺血、缺氧和坏死为主要病理表现^[1]。《金匮要略》最早记载了“胸痹”这一症状，在中医领域，冠心病被归类为“胸痹心痛”范畴。中医看来，“痰”反映了动脉粥样硬化以及血脂升高的情况，而“瘀”则体现了心肌缺血及血液流变学的异常变化，因此，痰瘀被视为冠心病发病的关键因素^[2]。代谢组学研究机体新陈代谢过程中产生的内源性小分子物质在种类、浓度或相对比例方面的变化。痰瘀互结证的核心是痰浊、瘀血等病理产物，也属于代谢产物的一部分，通过代谢组学研究，痰、瘀等继发性病理产物可得到定性描述与定量表征，痰瘀互结证的代谢机制有望得到进一步阐明^[3]。本研究以代谢组学和痰瘀互结为切入点，探索冠心病痰瘀互结证（CHD-TYHJ）患者和健康对照组的代谢物差异，为冠心病临床辨证施治提供理论及实验依据。

1 材料和方法 1.1 病例来源及分组

选取来自天津市胸科医院2023年3—7月，经1名主治医师和1名主任医师严格诊断后辨证为CHD-TYHJ的患者。正常对照组选取来自天津中医药大学第二附属医院体检科、无心脏病史和其他重大疾病的患者。根据疾病和证型共分2组，包括CHD-TYHJ组42例、正常对照组20例受试者。本研究已通过临床伦理审批（批号：2021KY-011-01）。

1.2 纳入排除标准 1.2.1 疾病诊断标准及证候诊断标准

西医诊断标准：参考《缺血性心脏病的命名及诊断》和《中国血脂管理指南2024年》。中医证候诊断标准：参考《中药（新药）临床研究指导原则2002版》和《中医内科学》，并由临床中医主任医师辅助诊断，提高准确性。

1.2.2 纳入及排除标准

1）纳入标准：①西医符合急性心肌梗死和高脂血症诊断标准（未检测心电图和心肌酶指标），中医符合痰瘀互结证诊断标准；②年龄在35~85周岁之间，性别不限。

2）排除标准：①诊断为非痰瘀互结证的中医证型患者；②合并严重神经及精神疾病的患者；③合并严重原发性疾病、恶性肿瘤患者；④妊娠期、哺乳期妇女。

3）样本剔除标准：血液样本出现污染或损坏者。

1.3 实验试剂与仪器

甲醇（ME）、甲酸、水、乙腈（ACN），均购自美国Sigma-Aldrich公司。超声波清洗机，购自美国Sigma-Aldrich公司；漩涡振荡器，购自德国IKA公司；台式高速冷冻离心机、冷冻浓缩离心干燥器，购自德国Eppendorf公司；高分辨质谱仪、高效液相色谱仪，购自美国Thermo Scientific公司；色谱柱，购自美国Waters公司。

2 研究方法 2.1 标本采集

使用真空采集管空腹采取受试者静脉血2 mL，常温静置1 h后进行血清提取，将血液在4 ℃下以4 000 r/min离心15 min，离心半径15 cm。取上清液并储存在-80 ℃冰箱中。

2.2 血清血脂检测

使用全自动生化仪检测两组血清中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平。

2.3 血清样本处理

在100 μL血清样本中加入3倍量甲醇，涡旋振荡后在13 000 r/min，4 ℃条件下离心15 min，离心半径8 cm，吸取上清备用。

2.4 液相色谱-质谱检测条件

1）色谱条件：流动相由水、乙腈、0.1% 甲酸（A）和0.1% 甲酸（B）组成，柱温40 ℃，流速0.4 mL/min，进样体积5 μL。优化梯度条件为0~3.5 min，5%~15%A；3.5~6.5 min，15%~30%A；6.5~12.5 min，30%~70%A；12.5~18.5 min，70%~100%A。

2）质谱条件：以两种离子模式进行质谱分析（MS）和串联质谱分析（MS/MS）扫描。以下参数设置如下：在正离子和负离子模式下，碰撞能量40 eV/40 eV，碰撞能量差20 V。ESI离子源参数设置如下：雾化压力（GS1）55 psi，辅助压力（GS2）55 psi，气幕压力35 psi，源温度500 ℃，喷雾电压5 500 V（正离子模式）或4 500 V（负离子模式），扫描范围100~1 500 Da。

2.5 数据处理与分析

首先将数据导入Progenesis QI软件进行峰提取，获得代谢物相关的质荷比、保留时间和离子面积等信息，采用多变量偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）模型前两个主成分的VIP值，结合单变量分析差异倍数和P值进行质荷比的筛选，通过检索人类代谢组数据库（HMDB）、京都基因和基因组百科全书数据库（KEGG）定性可能的差异性代谢物，最后对差异性代谢物所在的通路进行综合分析（包含富集分析和拓扑分析），找到与代谢差异物相关性最高的关键通路。

临床资料血脂数据采用SPSS 26.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

3 研究结果 3.1 临床资料比较

CHD-TYHJ组中男32例，女10例，平均年龄为（58.64±7.16）岁；正常对照组中男12例，女8例，平均年龄（57.23±7.93）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

3.2 血脂结果分析

与CHD-TYHJ组相比，正常对照组血清HDL-C水平显著降低（P < 0.01）、LDL-C水平降低（P < 0.05），TC和TG水平无显著差异（P > 0.05）。见表 1。

3.3 多元统计分析差异代谢物 3.3.1 代谢物主成分（PCA）分析

PCA分析结果显示CHD-TYHJ组与正常对照组的代谢物谱呈现一定的区分度。见图 1。

3.3.2 代谢物PLS-DA分析

PLS-DA分析结果见图 2。由图可知，CHD-TYHJ组与正常对照组代谢谱区分度良好。

3.3.3 代谢物正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）

采用OPLS-DA对CHD-TYHJ组与正常对照组进行多元统计比较，两组中大部分样本点在椭圆内，即95% 的置信区间内，2个比较组之间明显分离，说明两组的代谢物谱有显著改变。见图 3。OPLS-DA模型性能均良好，并且CHD-TYHJ组与正常对照组都能呈现良好的聚类效果，组间明显区分。见图 4。采用置换检验对OPLS-DA模型进行验证，Q2在Y轴截距均为负值，表明所建立的OPLS-DA模型未过度拟合，结果可靠。

3.4 冠心病痰瘀互结证差异代谢物 3.4.1 差异物分组聚类分析热图

利用数据库对CHD-TYHJ组与正常对照组的差异代谢物进行聚类分析，数据表明，两组差异代谢物的组间分离度良好；表明上述差异代谢物筛选方法合理可靠。见图 5。

3.4.2 代谢物差异柱状图

CHD-TYHJ组与正常对照组的差异代谢物，在正离子模式中，共有82个代谢物上调，19个代谢物下调；在负离子模式中，共有12个代谢物上调，19个代谢物下调。见图 6。正负离子整合模式下标志性代谢物见表 2。

3.5 冠心病心绞痛痰瘀互结证差异代谢物生物信息学分析

对冠心病痰瘀互结证的差异代谢物进行信号通路富集分析，与差异代谢物相关性较高的4个关键通路依次为甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢。见图 7。

4 讨论

冠心病是心血管系统的常见疾病，中医临床上以痰、瘀相关证较为多见。痰湿证是冠心病的病程发展阶段的一个证型，随着疾病的进展和变化，可能形成痰瘀互结证^[4]。此前张伯礼院士已经提出“痰瘀互生”的病因病机理论，认为痰瘀可互生，痰是瘀的初期阶段，瘀是痰浊的进一步发展，痰与瘀是疾病发生、发展、恶化的基本继发因素，痰瘀互生是“病重之源”^[5]。

本研究借助代谢组学筛选冠心病痰瘀互结的血清差异代谢物。通过对冠心病痰瘀互结患者的血清进行代谢组学分析，在正负离子整合模式下，有80个代谢物上调，36个代谢物下调，其中包括对羟基苯甲酸D-葡萄糖等关键差异代谢物。生物信息学分析显示，与代谢物差异相关性较高的4个关键通路依次甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢。甘油磷脂代谢在细胞生理过程中具有重要作用，其关键酶参与细胞膜的合成、修复和降解，维持细胞膜稳定。此前心肌脂质代谢研究发现，甘油磷脂代谢是治疗心力衰竭的关键通路^[6]。花生四烯酸代谢涉及环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素P450调控的3种代谢途径，广泛参与炎症反应和药物代谢等生理和病理过程^[7]。花生四烯酸与心血管疾病的发展密切相关，研究表明，花生四烯酸通过肌醇需求酶1α（IRE1α）/剪接型X盒结合蛋白1（XBP1s）/Runt相关转录因子2（RUNX2）/ 骨桥蛋白（OPN）信号级联参与高盐饮食诱导的冠状动脉重塑^[8]。亚油酸代谢是脂肪酸合成和分解的机制，其重要功能之一就是对人体血糖的控制。亚油酸代谢可能对慢性心力衰竭发挥保护作用^[9]。α-亚麻酸代谢具有抗代谢综合征、抗炎、抗氧化、抗肥胖等作用，实验研究证实，α-亚麻酸可预防心室颤动、降低血小板聚集^[10]。

此前研究表明，冠心病心绞痛痰瘀互结证患者血清标志性代谢差异物为6-去氢睾酮葡糖苷酸、甘氨鹅脱氧胆酸等^[11]。冠心病痰瘀互结证患者血清中涉及的代谢通路包括赖氨酸降解、氰基氨基酸代谢、甲苯降解、亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、咖啡因代谢、视黄醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、细胞色素P450通路^{[4, 12-14]}。本研究与此前研究的代谢通路基本一致，而α-亚麻酸代谢为首次在冠心病痰瘀互结患者血清代谢组学研究中发现，为冠心病痰瘀互结证的代谢研究丰富了生物基础。