冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）是临床最常见的心血管疾病之一，其病理表现为冠状动脉因粥样硬化病变导致管腔狭窄、痉挛或阻塞，继而引发心肌缺血、缺氧乃至坏死^[1]。《中国心血管健康与疾病报告2023》报告显示，中国冠心病患者约1 139万，其中城市与农村地区的患病率分别为892/10万和639/10万，已构成重大公共卫生负担^[2-4]。心绞痛是冠心病常见类型，临床常采用介入、搭桥等手段改善症状，并以硝酸酯类血管扩张剂及β受体阻滞剂等药物进行治疗。尽管西医防治冠心病疗效显著，介入及外科手术等方法日益完善，但诸如血运重建后无复流或慢血流等临床问题仍需进一步改善^[5]，故寻找安全有效的方药辅助防治冠心病的发生发展已成为研究热点。

血府逐瘀胶囊源于清代王清任编撰的《医林改错》经典方剂血府逐瘀汤，具有活血祛瘀、理气镇痛的作用，常用于气滞血瘀型冠心病、心绞痛的治疗^[6]。现代药理学研究证实，血府逐瘀胶囊具备多重药理效应，包括扩张冠状动脉血管、提升心肌供血、促进微循环以及抑制炎症反应，从而有效改善心脏血流并发挥抗炎作用，在减少主要心血管事件发生方面具有重要作用^[7-9]。随着微生态学研究的不断发展，舌苔微生态成为了新的研究热点。多项研究证实舌苔菌群与冠状动脉粥样硬化斑块形成及冠心病的病程进展密切相关^[10-11]。据此，舌苔菌群可作为冠心病舌象研究的拓展点，通过分析舌苔菌群特征，从微生态学的角度丰富舌诊信息，为冠心病的诊断提供更全面、更客观的依据，从而为临床诊疗和预后评估提供科学支持。

在课题组前期中成药辅助治疗冠心病心绞痛的前瞻性队列研究（CSCD-TCM）基础上，本研究采用16S rDNA高通量测序技术对冠心病心绞痛气滞血瘀证患者的舌苔样本进行检测，研究血府逐瘀胶囊对冠心病心绞痛气滞血瘀证舌苔菌群的影响，为血府逐瘀胶囊临床应用提供实验依据。

1 资料与方法 1.1 研究对象

本研究采用前瞻性、多中心的临床试验设计，2021年4月—2022年11月从天津中医药大学第一附属医院、天津中医药大学第二附属医院、天津市南开医院、天津市胸科医院、天津医科大学总医院以及天津市中医药研究院附属医院中，选取符合气滞血瘀型冠心病心绞痛诊断的患者作为研究对象。依据既定的诊断规范、入选条件与排除标准，筛选出符合条件的病例。根据患者是否服用血府逐瘀胶囊进行分组，最终将入组人群划分为3组：血府逐瘀胶囊治疗组（联合西医常规治疗）、西医常规治疗组、正常对照组，每组各筛选30例典型病例，其中正常对照组来自2022年8—11月课题组冠心病研究医疗协作单位体检中心的健康人群。共纳入样本90例，按1∶1∶1分配。基于课题组前期试验获得的效应量（Cohen’s f=0.62），经G*Power 3.1计算，在α=0.05、检验功效80% 条件下，每组28例即可满足单因素方差分析的要求；考虑5%~7% 的预期失访，最终确定每组30例，共90例。所有研究对象均在研究开始前签署知情同意书。本临床试验方案已获得伦理委员会批准（伦理号：TJUTCM-EC20190008），并均在美国与中国的临床试验注册中心完成注册，注册号分别为NCT04022031与ChiCTR1900024532。

1.2 诊断标准

西医诊断标准参照《慢性稳定型心绞痛治疗指南》^[12]，符合以下任1项即可诊断：1）有明确陈旧性心肌梗死病史。2）冠状动脉造影或电子计算机断层扫描血管造影（CTA）提示至少1支主支血管狭窄≥50%。3）血运重建术后伴心电图ST段压低或T波倒置。

不稳定型心绞痛的诊断参照《不稳定性心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南》^[13]，其涵盖门类包括静息型、初发型、恶化劳力型及变异性心绞痛。

中医气滞血瘀证辨证参考标准依据《中药（新药）临床研究指导原则2002版》^[14]，同时具备以下3项可确立诊断：1）胸痛胸闷，日久不愈，痛如针刺而痛有定处。2）舌质暗红或有瘀斑、瘀点。3）脉涩或弦紧。

1.3 纳入及排除标准 1.3.1 纳入标准

1）年龄35~75岁，性别不限。2）冠心病心绞痛诊断符合西医诊断标准和中医辨证标准。3）符合使用药物治疗标准。4）自愿参加临床研究试验并签署知情同意书。

1.3.2 排除标准

1）合并神经官能症、更年期综合征、甲亢、特定类型颈椎病、胃-食管反流病等可能引起胸痛的疾病。2）患有控制不佳的严重症状或重大疾病（如急性心肌梗死、心力衰竭、心肌病、肝肾功能衰竭、恶性肿瘤、糖尿病等）。3）孕妇、哺乳期或计划生育的育龄妇女。4）存在精神疾病或认知功能障碍。5）近3个月内参加过其他临床试验。

1.3.3 正常对照组纳入标准

1）年龄35~75岁，性别不限。2）无重要系统（如循环、呼吸、消化、泌尿、内分泌等）的器质性疾病史；若既往曾罹患上述疾病，则需确保近两年内无症状复发，且体格检查结果正常。3）所有受试者均须完成全面体格检查，且选择性检查项目（包括胸部透视、心电图、血生化、肝肾功能等）结果均无异常。4）依据国际疾病分类（ICD）-11标准，排除已明确诊断患有任何疾病的个体^[15]。

1.4 治疗方法

冠心病心绞痛患者依据是否服用血府逐瘀胶囊进行分组，分为血府逐瘀胶囊治疗组（联合西医常规治疗）和西医常规治疗组^[16]。

西医常规治疗组：以《2007年中国慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》^[17]推荐的方案为主，涉及抗血小板聚集、他汀调脂、β受体阻滞剂等多种药物，持续治疗8周。

血府逐瘀胶囊治疗组：在接受西医常规治疗的同时，增加口服血府逐瘀胶囊（天津宏仁堂药业有限公司，规格0.4 g/粒）的治疗，剂量为每次6粒，每日2次，治疗周期亦为8周。

正常对照组：不给予药物治疗，观察周期为8周。

2 方法 2.1 舌苔菌群采集

嘱受试者清晨未进食前用0.9%无菌氯化钠溶液漱口2~3次，采用无菌拭子对舌苔表面2 cm×2 cm范围的中间区域进行两次刮取，完成刮取后将其放置于含有750 μL DNA保存液的5 mL离心管内，并转移到-80 ℃冰箱中保存。

2.2 菌群样本测序及分析

提取样本DNA，采用含Barcode的特异性引物扩增16S V4区、18S V4区、18S V9区、ITS1区、ITS2区，根据PCR产物浓度进行等浓度混样，样本充分混匀后进行纯化，使用TruSeq^® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit构建文库，经Qubit定量与文库质检后，在HiSeq平台上机测序。对测序得到的reads进行序列拼接，使用Uparse按照97% 的精度将数据的序列分组聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），随后用RDP classifier算法将OTUs的代表序列比对至相应的参考数据中进行物种注释。基于OTUs分析结果，对样本在各个分类水平上进行分析，获得各样本在门、属分类学水平上的群落结构图，从而分析冠心病心绞痛气滞血瘀证患者舌苔菌群的多样性。使用Chao1指数和Observed Species指数评估舌苔菌群的丰富度，Shannon指数和Simpson指数评估舌苔菌群群落的多样性，绘制稀释曲线评估数据饱和度。通过PCoA分析比较治疗组间物种组成差异，通过Adonis检验验证组间显著性，最后使用STAMP软件LEfSe筛选差异菌群，解析冠心病心绞痛气滞血瘀证患者舌苔菌群特征。

2.3 统计学方法

使用SPSS 24.0软件进行统计。计量资料若满足正态分布采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析；计量资料如呈偏态分布，则以中位数与四分位数间距[M（IQR）] 表示，并采用Kruskal-Wallis H检验进行组间比较；分类变量以例数（百分比）描述，组间比较使用χ²检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 一般资料

在性别分布上，正常对照组（男18例，女12例）、血府逐瘀胶囊治疗组（男21例，女9例）与西医常规治疗组（男26例，女4例）呈现相似分布，卡方检验表明组间差异无统计学意义（P > 0.05）。在年龄方面，3组的中位年龄分别为62.50、65.00和60.50岁，非参数检验同样差异未见统计学意义（P > 0.05）。综上，3组在年龄与性别方面具有可比性。见表 1。

3.2 菌群16S rDNA测序结果与数据分析 3.2.1 基于OTU的Venn图分析

基于样本的OTU分类，计算样本之间相同OTU数量，并绘制Venn图。正常对照组OTU值为8 060，血府逐瘀胶囊治疗组OTU值为5 610，西医常规治疗组OTU值为6 098，冠心病心绞痛气滞血瘀证OTU值为10 164，共有的OTU值为2 748。冠心病心绞痛气滞血瘀证与血府逐瘀胶治疗组之间的共同OTU值为4 368；冠心病心绞痛气滞血瘀证与西医常规治疗组之间的共同OTU值为4 510。各组特有的OTU值分别为：正常对照组1 153；血府逐瘀胶囊治疗组282；西医常规治疗组524。初步显示出健康组菌群群落更丰富。见图 1。

3.2.2 群落结构组分图

依据物种注释结果，选取了门与属水平上丰度排名前10位的物种，并绘制了相对丰度柱形累加图。见图 2，图 3。并列出各属菌种在各组的具体占比。见表 2，表 3。

结果显示，在门水平分类下各组相对丰度排名前10位的物种分别为拟杆菌门、变形杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、梭杆菌门、髌骨细菌门、蓝细菌门、Epsilon杆菌门、酸杆菌门、螺旋体门。其中以拟杆菌门、变形杆菌门、厚壁菌门、放线菌门4种菌门最为丰富。

在属水平分类下各组相对丰度排名前10位的物种分别为普雷沃菌属_7、奈瑟菌属、链球菌属、梭杆菌属、罗斯氏菌属、嗜血杆菌属、韦荣球菌属、普雷沃菌属、放线菌属、异普雷沃氏菌属。

3.2.3 菌群α多样性分析

稀疏曲线：本次实验中，当测序量达到40 000条之后开始逐步进入平稳期。见图 4。这表明本次舌苔菌群测序数据足以反映菌群种类的大部分信息。

α多样性指数组间差异分析：α多样性分析用于分析样品内的微生物群落多样性。Shannon指数和Simpson指数为菌群多样性指数；Ace指数和Chao 1指数为菌群丰度指数。分析结果显示，正常对照组与冠心病心绞痛气滞血瘀患者及血府逐瘀胶囊治疗组与冠心病心绞痛气滞血瘀证患者之间的Shannon、Simpson、Ace和Chao 1指数经wilcoxon检验后P > 0.05，差异无统计学意义。结果表明，经血府逐瘀胶囊联合治疗或单纯西医常规治疗后，冠心病心绞痛气滞血瘀证患者与正常对照组的舌苔菌群样本，在物种丰度及多样性方面均未见显著改变。见图 5。

菌群β多样性分析：研究采取了β多样性指数组间差异分析、PCoA分析进行组间β多样性分析，并采用Adonis进行组间群落结构差异显著性检验。基于Weighted-Unifrac距离检验后发现，与正常对照组相比，冠心病组的β多样性指数较低，差异具有统计学意义（P < 0.001），在血府逐瘀胶囊治疗后，β多样性指数降低（P < 0.001）；与西医常规治疗组治疗8周后相比，血府逐瘀治疗组8周后的舌苔菌群β多样性指数较低（P=0.001）。见图 6。

主坐标分析（PCoA）结果显示，基于WeightedUnifrac距离算法结果，第1主成分对菌群差异的贡献度为23.97%，第2主成分对菌群差异的贡献度为18.67%。基于Unweighted-Unifrac距离算法结果，第1主成分对菌群差异的贡献度为18.30%，第2主成分对菌群差异的贡献度为8.82%。见图 7。

结果表明，正常对照组与冠心病心绞痛气滞血瘀证患者的菌群结构存在显著差异；此外，在接受血府逐瘀胶囊联合西医治疗后，其菌群与治疗前相比亦发生了明显改变。并使用Adonis分析方法进行组间群落结构差异显著性检验。Adonis分析结果显示R²=0.037，表示分组对菌群差异的解释度较高，且P=0.001，检验的可信度高。

3.2.4 菌群LEfSe分析

通过筛选后，LEfSe的分析结果显示，正常对照组中有差异菌群d的是芽孢杆菌科、芽孢杆菌属、SR1_bacterium_taxon_345和普雷沃菌属_1。冠心病心绞痛气滞血瘀证患者的差异菌群是毛螺旋菌属。血府逐瘀胶囊治疗组的差异菌群是罗斯氏菌属、微球菌科、微球菌目、放线菌门和放线菌属。西医常规治疗组的差异菌群是莫拉菌科。见图 8。

4 讨论

舌苔是由舌苔菌群以及多种口腔残留物，包括脱落的口腔上皮细胞、白细胞、血液代谢产物等组成^[10]。口腔微生物组与心血管疾病之间的联系一直备受关注，研究报道，口腔菌群失调不仅是动脉硬化发生与加重的潜在诱因^{[12, 17-18]}，也与心血管事件的多项风险系数显著正相关^[19]。另有基于16S rRNA扩增子测序的结果表明，冠心病患者的动脉斑块内含有通常来源于口腔的细菌（如致牙周炎与龋齿菌种），且其口腔微生物组成与龋齿患者相似性高，提示口腔微生物与冠心病之间或存在关联^[20]。此外，1项研究结果表明，积极进行口腔炎症的治疗可以减少全身炎症的发生，同时还可降低因口腔微生态失调导致的血脂水平等指标异常，这些都有助于预防冠心病的发生与进展^[21]。

本研究分析了血府逐瘀胶囊治疗前后舌苔菌群丰度的变化，发现经血府逐瘀胶囊干预后，冠心病心绞痛气滞血瘀证患者的拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门丰度升高，变形杆菌门丰度下降，阐明了血府逐瘀胶囊对于舌苔菌群具有一定的调节作用。其中，拟杆菌门中多数菌株都为有益菌，有研究表示，肠道微生物群中的粪副拟杆菌含量升高，能增强对支链氨基酸的分解代谢，致使动脉斑块中巨噬细胞的mTORC1信号通路被抑制，其抗动脉粥样硬化作用由此实现^[22]。另有研究发现，在拟杆菌门中比较有代表性的菌属是普氏菌属，普氏菌属的上调会降低心肌梗死风险^[23]。本研究中可见普氏菌属在进行血府逐瘀胶囊治疗后丰度提高，这与之前的研究结果相同^[24-25]，说明普氏菌属在冠心病的发生发展过程中起到一定的作用。此外，菌群LEfSe分析显示，血府逐瘀胶囊治疗组的差异菌群是罗斯氏菌属，这是目前公认的有益菌。它是丁酸盐的重要生产者，丁酸盐是结肠细胞的主要能量来源，对维持肠道屏障功能至关重要，并能有效抑制炎症、调节免疫^[26]。血府逐瘀胶囊治疗后罗斯氏菌属的增加，可能是其发挥疗效的机制之一：即通过重塑菌群，增加有益菌，促进丁酸盐产生，从而减轻全身性低度炎症，改善血管功能。厚壁菌门和放线菌门在血府逐瘀胶囊干预后丰度均有所上升。放线菌门中包含的有益菌是双歧杆菌，其产生的作用为降低血脂水平以及抗氧化，其作用机制可能是通过巨噬细胞活化抑制前脂肪细胞的分化，进而参与血脂的代谢过程相关^[27-28]。乳酸杆菌作为厚壁菌门代表性的微生物，有研究表明乳酸杆菌可能是通过调节血清IL-6、同型半胱氨酸与尿酸水平，影响冠心病的发生发展^[29-30]。据此推测，血府逐瘀胶囊具有的抗氧化和降血脂作用，可能是通过上调厚壁菌门和放线菌门的丰度来实现的，进而抑制冠心病心绞痛气滞血瘀证的发生发展，但其具体的疗效机制仍需进一步研究。

实验结果可知，有害菌变形杆菌门的丰度在使用血府逐瘀胶囊干预后下降。变形杆菌其丰度与动脉粥样硬化的发生呈正相关^[31]。有研究表明，奈瑟菌属作为变形杆菌门的代表菌属，常以人体呼吸道条件致病菌存在，其与牙菌斑生物膜形成相关。牙菌斑生物膜的过量沉积易导致牙周炎，而微生物内环境失衡能促使病原体毒力因子的表达。例如牙髓卟啉单胞菌，它可在牙根尖区引起炎性反应，并通过分泌蛋白酶等毒性物质破坏牙周组织，进而定植于动脉斑块中。这一过程被认为是可能引发动脉粥样硬化与冠心病患病风险的潜在因素^[32]。

综上所述，冠心病心绞痛气滞血瘀证患者与正常对照组之间舌苔菌群多样性、丰富度和群落结构有显著差异。冠心病患者舌苔菌群存在特征性改变，其菌群特征有望作为诊断冠心病及辨别证型的指标。同时，也为血府逐瘀胶囊的临床应用提供了实验依据。

此外，本研究还存在一定的局限性。首先，样本量较小，未进行稳定型和不稳定型心绞痛亚组分析，可能存在一定的选择偏倚和信息偏倚。其次，未能进行菌群变化与量化临床疗效指标的相关性分析，可能无法直接从统计学上论证两者间的关联强度。因此，在今后的研究中将通过扩大样本量、进行亚组分析、收集量化临床疗效指标以及纳入同病异证或异病同证对照组，以进一步明确血府逐瘀胶囊调节菌群的特异性。