月经性癫痫（CE）是指在月经周期中的某个时期，癫痫发作频率增加、较平时两倍以上或者程度恶化者^[1]。在女性癫痫中，约40% 以上的患者属于CE^[2]。目前CE发病机制尚不完全清楚，国内外文献研究表明CE的癫痫发作与周期性的雌激素、孕激素、雌孕激素比值以及神经中枢的激素受体等水平变化有一定关系^[3]。高水平雌激素可促进CE发生，其发生机制有多种。其中，在高水平雌激素作用下，神经元大量释放谷氨酸，在组织间隙过度堆积，激活离子型谷氨酸受体，以N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体为著，是细胞外大量钙离子内流，细胞内钙超载而引起癫痫发作^[4]。因此，通过调控NMDA通路可减轻CE癫痫发作。

CE现尚无国际统一的治疗专用药物，特殊饮食也有一定疗效^[5]；基于目前西药治疗CE存在疗效差、激素波动、药物不良反应等问题，中医治疗CE迎来了新的机遇。近年来，中医通过辨证论治CE临床取得一定疗效，包括中药、针灸等^[6-7]。马融教授根据小儿“肾常虚”生理特点，结合“肾-骨-髓- 脑、肾-天癸-冲任-胞宫”中医理论，提出从肾论治CE的学术思想，临床应用补肾调经、豁痰息风之茸菖胶囊治疗CE疗效显著，且不影响天癸已至的CE患者月经周期。团队前期动物实验^[8]已验证茸菖胶囊干预CE模型大鼠的作用机制，且目前尚无基于神经元模型探讨中医药干预CE的报道，故拟建造外源性添加雌二醇（E₂）的无镁诱导CE神经元模型，从细胞实验层面开展基于NMDA通路的茸菖胶囊干预CE神经元模型的作用机制研究，以期为中药干预CE提供新证据及新思路。

1 实验材料 1.1 实验动物

出生24 h内的健康雌性SD幼鼠20只，SPF级，购自北京大学医学部实验动物科学部[生产许可证号：SCXK（京）2016-0010]。健康成年大耳白家兔（雌性）4只，普通级，体质量2.5~3.0 kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司[生产许可证号：CYXK（京）2015-0008]。实验中有关于动物的所有操作程序均严格遵守《实验动物管理条例》《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892- 2018）。

1.2 主要仪器与试剂 1.2.1 主要仪器

膜片钳放大器（德国Heka公司，型号EPC-10）、显微镜（日本Olympus公司，型号Ⅸ71）、二氧化碳恒温培养箱（新加坡ESCO公司，型号CCl-170B-8）、倒置相差显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司，型号BDS200）、垂直电泳槽（北京市六一仪器厂，型号DYCZ-24DN）、多功能酶标仪（美国BioTek公司，型号Synergy 4）等。

1.2.2 主要药品及试剂

茸菖胶囊（由天津中医药大学第一附属医院提供，生产批号津药制字Z20070735号）、丙戊酸钠（Sigma公司，货号P4543），E₂（Sigma公司，货号E8875-1G）、氯化镁（Sigma公司，货号M2393）、葡萄糖（Glucose，Sigma公司，货号G8270）、神经元专用培养基（Gibco公司，货号10313）、胎牛血清（FBS，Gibco公司，货号10099141C）、0.25%-胰蛋白-EDTA消化（Gibco公司，货号25200- 072）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，Takara公司，货号T900）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，Santa Cruz公司，货号SC-29097A）等。

1.2.3 主要配制溶液

PBS/HEPES/Glucose缓冲液（H-PBS）、接种液、神经元完全培养基、无镁HBSS溶液、含镁HBSS溶液、1.0 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）缓冲液、1.0 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液、10% 十二烷基硫酸钠溶液（SDS）、10% 过硫酸铵溶液（AP）、NMDA通道溶液等。

2 实验方法 2.1 茸菖脑脊液制备

将大耳白家兔适应性喂养3 d后，灌服茸菖胶囊，每次9.2粒（按人兔给药换算得每次灌胃药量），每日3次给药。连续喂养3 d，末次给药1 h后耳缘动脉注入空气处死，于小脑延髓池穿刺采集清亮脑脊液^[9]，-80 ℃冻存备用。

2.2 原代海马神经元的培养

将新生24 h内的SD幼鼠断头取脑组织，在PBS缓冲液中剥离出双侧海马快速剪成碎片，胰蛋白酶消化20 min，加入冰的H-PBS终止反应，再加入接种液，反复吹打收集上清液，接种于处理过的细胞培养板，37 ℃、5% CO2孵箱中培养4 h，再用接种液清洗1次后换用神经元专用培养基培养。

2.3 癫痫细胞放电模型建造

采用无镁短暂处理法建立癫痫神经元模型（Sombati癫痫细胞放电模型）^[9]，当海马神经元细胞培养到9 d时用无镁HBSS溶液替代含镁神经元培养基，37 ℃、5% CO2温箱孵育3 h后，即得到自发持续高频放电的神经元细胞，继而将HBSS溶液再次更换为NB培养基继续培养。在癫痫神经元中添加E₂建立CE神经元模型。模型建立后，通过电生理实验来鉴定是否造模成功。

2.4 实验分组

将海马神经元培养12 d。各组予不同处理液后均放温箱中孵育，随机分为7组：对照组予含1 mmol/L含镁HBSS溶液3 h；癫痫模型组予无镁HBSS溶液3 h；月经性癫痫模型组予无镁HBSS溶液3 h，换为加入1 μmol/L E₂及10% 正常脑脊液；丙戊酸钠组予无镁HBSS溶液3 h，换1 μmol/L E₂及100 mg/L丙戊酸钠；茸菖低剂量组予无镁HBSS溶液3 h，换1 μmol/L E₂及5% 茸菖脑脊液；茸菖中剂量组予无镁HBSS溶液3 h，换1 μmol/L E₂及10% 茸菖脑脊液；茸菖高剂量组予无镁HBSS溶液3 h，换1 μmol/L E₂及20% 茸菖脑脊液。

2.5 观察指标 2.5.1 倒置相差显微镜

将各组神经元细胞放置于倒置显微镜下观察各组神经元数量、大体形态、细胞胞体轮廓、突起形态及长度、细胞密度等指标并拍照。

2.5.2 膜片钳电生理记录

经细胞外液置换，采用倒置显微镜选取细胞膜完整、呈三角形或椭圆形、边界清晰的神经元细胞，经电极内液灌注、封接、破膜，形成全细胞模式。自发动作电位刺激：给予细胞-80 mV的钳制电压，然后将细胞记录模式转换为电流钳模式（C-Clamp），刺激电流为0 pA，维持时间60 s。NMDA通道刺激：保持电压（Vh）-80 mV，给予不同强度条件脉冲电压刺激，持续时间60 s，伴灌流液短暂灌流，膜片钳放大器拾取此过程中的NMDA电流信号，软件采集并分析。

2.5.3 蛋白免疫印记法

提取海马神经元蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度后进行蛋白变性，用凝胶电泳分离，PVDF转膜并封闭，经一抗、二抗孵育，用胶片进行曝光。用Image J软件分析灰度值，统计NMDA受体1（NR1）、NMDA受体2A（NR2A）蛋白表达。

2.6 统计学方法

采用SPSS22.0软件对实验数据进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。如符合正态分布时，多组之间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD/Dunnett’s T3。如不符合正态分布，则采取秩和检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 各组海马神经元放电代表图比较

膜片钳全细胞记录模式下，用电流钳对细胞进行钳制，记录各组神经元自发性动作电位。对照组：正常神经元细胞仅出现偶发动作电位；癫痫模型组：神经元出现反复高频高幅棘波放电；CE模型组：神经元出现阵发性去极化漂移（PDS）并产生反复自发的高频高幅棘波放电，可判断CE神经元模型建造成功^[9]。丙戊酸钠组及茸菖中、高剂量组：神经元PDS及高频放电均可见减少，茸菖高剂量组放电减少尤为明显。茸菖低剂量组未见高频放电减少。见图 1。

3.2 各组海马神经元形态比较

将各组海马神经元细胞放在倒置相差显微镜下观察形态、轮廓及细胞密度等。对照组：正常神经元细胞胞体及胞质略丰富，可形成稠密的神经网络；癫痫模型组：同一视野内神经元数目减少，胞体略小，神经网络稍稀疏；CE模型组：神经元同一视野范围内细胞数目明显减少，胞体减小，神经网络明显稀疏。与CE模型组相比较，丙戊酸钠组同一视野下神经元数目明显增多，但胞体略小，神经网络密集度增加；茸菖低剂量组神经网络密集度增加；茸菖中剂量组神经网络密集度明显增加；茸菖高剂量组神经元数目增多，胞体较丰满，神经网络密集度明显增加。见图 2。

3.3 各组海马神经元自发动作电位放电频率与静息膜电位比较

每个自发放电数据记录10 min，在数据分析时，有些细胞发放不均匀，选取的是发放均匀的2 min。对于发放次数很少的，频率的计算方式为发放次数/120 s。膜电位选取的时间段与计算频率时相同。结果显示：与对照组相比，癫痫模型组放电频率增加、静息膜电位升高，但差异无统计学意义（P>0.05）；CE模型组放电频率明显增加、静息膜电位明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。与CE模型组相比，丙戊酸钠组放电频率明显减少（P < 0.05）、静息膜电位未见明显降低（P>0.05）；茸菖低剂量组放电频率、静息膜电位变化差异均无统计学意义（P>0.05）；茸菖中剂量组放电频率变化差异无统计学意义（P>0.05）、静息膜电位明显降低（P < 0.01）；茸菖高剂量组放电频率明显减少、静息膜电位明显降低（P < 0.05）。见表 1。

3.4 各组海马神经元24 h NMDA通道电流密度比较

在全细胞记录下，给予细胞持续60 s的不同强度电压（分别为-60、-40、-20、0、20和40 mV）刺激，40 mV钳制电压时，各组通道开放后的平均电流密度最大。选择在40 mV钳制下的NMDA受体电流作分析。结果显示：与对照组相比，癫痫模型组24 h NMDA电流密度未见明显降低（P>0.05）；CE模型组24 h NMDA电流密度明显增加（P < 0.05）。与CE模型组相比，丙戊酸钠组24 h NMDA电流密度未见明显降低（P>0.05）；茸菖高剂量组24 h NMDA电流密度明显降低（P < 0.05）；茸菖低、中剂量组24 h NMDA电流密度未见明显降低（P>0.05）。见表 2。

3.5 各组海马NR1、NR2A蛋白表达比较

与对照组相比，癫痫模型组NR1蛋白表达明显降低（P < 0.01）、NR2A蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；CE模型组NR1蛋白表达明显降低、NR2A蛋白表达明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。与CE模型组相比，丙戊酸钠组NR1、NR2A蛋白表达均无明显差异（P>0.05）；茸菖低、中、高剂量组NR1蛋白表达均无明显差异（P>0.05），茸菖低、高剂量组NR2A蛋白表达均明显降低（P < 0.05），茸菖中剂量组NR2A蛋白表达无统计学差异（P>0.05）。见表 3、图 3。

4 讨论

CE分3型：月经期CE（C₁型）、排卵期CE（C₂型）、黄体功能不全型CE（C₃型）^[10]。目前CE的动物模型有3种^[10]：1）神经甾体戒断模型，模拟月经前孕激素的突然撤退，为模拟C₁型动物模型。2）动情周期模型，可观察雌性大鼠整个动情周期情况，可模拟不同型的动物模型。3）外源性添加E₂模型，模拟排卵期高雌激素状态，为模拟C₂型动物模型。因细胞实验在体外进行，难以模拟神经甾体戒断和动情周期，故选择外源性添加E₂来模拟排卵期高雌激素状态，建造C₂型CE细胞模型。Zhang等^[11]在癫痫神经元模型中证实：低剂量E₂的对癫痫样活动具有抑制作用，高剂量的E₂可促进癫痫样活动。依据文献^[12]及前期预实验，本实验最终采用了1 μmol/L的E₂造模剂量，在此剂量下证实癫痫神经元放电明显增加，出现PDS（Sombati癫痫神经元模型建造成功的指标）说明C₂型CE细胞模型制备成功。

高雌激素水平促进癫痫发作的机制有多种，包括：1）直接作用于海马CA1区，增加神经元突触联系，降低痫性发作的阈值，增加神经兴奋性。2）降低γ-氨基丁酸介导的抑制作用。3）增加NMDA介导的谷氨酸受体的神经兴奋性。4）正向调节脑源性神经营养因子的基因表达，激动酪氨酸激酶受体（trkB），增加海马区谷氨酸介导的神经兴奋性。5）增加背侧海马突触体素P38的表达及增强微管相关蛋白免疫活性的表达，海马兴奋性递质释放增加，神经兴奋性增强等^[13]。本研究结果表明，高剂量E₂具有促癫痫作用，可下调NR1、上调NR2A蛋白的表达，增加NMDA介导的神经的异常兴奋，与目前高雌激素可增强NMDA受体电流的研究结果一致^[14]。癫痫发生后NMDA受体变化的研究结果不尽相同，其中多数研究发现NR1、NR2A蛋白表达均上调可促进癫痫发作，但也有研究发现反复发作的癫痫模型鼠NR1蛋白表达明显下调^[15]，本研究结果与后者结果一致。癫痫反复发作引起NR1蛋白表达量下调，可能为自我保护作用，以减轻因反复发作造成的损伤。

抗癫痫药物治疗CE疗效局限，且可能影响女性患者的月经周期。采用中医药治疗CE临床取得一定疗效，未见影响女性患者的月经周期的报道，且可纠正月经周期的紊乱^[6]，因此具有其特殊优势。马融教授认为CE属虚痫，以肾精亏虚为本，病变部位在肾，常涉及心肝，病机关键为肾精亏虚，肾气不足，每因月经周期中阴阳转化不利而触发，风痰涌动，内扰神明，外闭经络而发为癫痫。采用益肾填精为治则，补肾调经为治法，使肾气充足，阴阳得以顺利转化，气机调顺以治其本；豁痰息风以治其标，使痰清风静而痫止。茸菖胶囊是以从肾论治为原则的中成药，具有补肾填精充髓、豁痰息风、调理冲任、调和阴阳的功效，治疗CE患者疗效肯定。网络药理学研究表明，茸菖胶囊发挥抗癫痫作用的机制可能与调节雌激素水平有关^[16]。团队前期从动物实验进一步证实，茸菖胶囊通过下调血清雌激素水平和海马ERα、ERβ、NR1的表达，从而减轻雌性癫痫模型大鼠动情期惊厥发作。本研究针对茸菖胶囊对高雌激素诱导的无镁癫痫神经元的影响，从细胞实验层面进一步探明，与丙戊酸钠和低、中剂量茸菖胶囊相比，在高剂量茸菖胶囊干预后神经元放电频率明显减轻，说明高剂量茸菖胶囊干预效果较好。茸菖胶囊（高剂量组）可减轻高雌激素癫痫神经元的异常放电，可能通过下调节NR2A表达，降低NMDA通道电流，从而减轻其介导的神经的异常兴奋。结合前期研究，从临床→网络药理学→动物实验→细胞实验，多角度证实了茸菖胶囊干预CE的有效性及其作用机制。

CE患者的发作与周期性雌、孕激素水平的变化密切相关，但离体细胞实验无法模拟复杂的月经期性激素水平动态变化，无法反映人体复杂的生理环境和整体反应（如雌孕激素的相互影响等）。此外，本研究细胞实验为短期实验，难以评估茸菖胶囊的长期效应机制，存在一定的局限性。后期可开展茸菖胶囊的长期实验，评估其结果的稳定性和可重复性；或利用人工智能、生物工程等技术，开发更优化的CE细胞模型，为推动研究成果向临床应用转化提供一定依据。