哮喘是一种涉及多种细胞及其组分的气道炎症性疾病，具有高患病率、高致残率特点^[1]。嗜酸性粒细胞（EOS）是气道炎症进程的主要参与者^[2]，如何改善EOS介导的气道炎症是控制哮喘的核心机制。目前研究证明靶向诱导Eos铁死亡能有效缓解哮喘气道炎症^[3]。核受体共激活因子4（NCOA4）介导的铁自噬通过调控细胞铁稳态成为铁死亡的上游机制^[4-5]。由此推测，NCOA4介导的铁自噬调控Eos铁死亡可能是控制哮喘气道炎症的关键环节。

哮喘属中医“哮病”范畴，具有起病急促、速发速止的特点，与“风哮”特点相合。久病入络，瘀血乘肺，影响气血津液布散，因此，“风邪袭肺，肺络瘀滞”是哮喘主要证素特点。选取肺俞、风门、孔最、鱼际4穴相配，具有疏风宣肺，理气通络之功。既往研究表明能降低氧化应激损伤，调节铁代谢，改善免疫应答，减轻气道炎症水平，具体机制仍未探明^[6-8]。本研究探索“疏风通络”配穴通过NCOA4介导的铁自噬调控哮喘气道炎症的可能机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

雄性野生型C57BL/6清洁级小鼠48只，8~12周龄，体质量18~22 g，购买自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物使用许可证号：SYXK（津）2021-0003。小鼠适应性饲养1周，室内温度（22±2）℃，相对湿度（55±10）%，12 h光暗交替，小鼠自由摄食、饮水。所有动物实验方法遵循天津医学动物实验中心指导原则（伦理批号：YSYDWLL-2024617）。

1.2 主要试剂和仪器

卵清蛋白购自美国Sigma公司；氢氧化铝干粉购自天津天力生化有限公司；RIPA裂解液购自上海碧云天生物有限公司；抗NCOA4抗体（1∶1 000）购自英国Abcam公司；抗铁蛋白重链1（FTH1）抗体（1∶1 000）购自BOSTER公司；抗谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗体（1∶1 000）购自Proteintech公司；蛋白定量分析（BCA法）试剂盒购自biosharp公司；活性氧（ROS）检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；亚铁离子比色法测试盒购自深圳迈瑞公司原厂试剂；还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素（IL）-4、IL-13购自凡科维公司；一次性无菌针灸针（0.25 mm× 13 mm）。

高速低温组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司，型号KZ-Ⅲ-F）；低温高速离心机（北京北利，型号GTR16-2）；电泳仪（北京六一，型号DYY- 6C）；酶标仪（北京普朗科技有限公司，型号DNM- 9602）；紫外分光光度计（上海让奇，型号D8PCS）；实时定量聚合酶链反应（PCR）仪（ThermoFisher Scientific公司，型号QuantStudio 1）；磁性分离器（Miltenyi Bio-tech公司，德国）全自动化学成像分析仪（GE Healthcare公司，型号Amersham lmager 600）；正置光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社，型号BX43）。

1.3 动物分组和模型建立

将48只小鼠随机分为空白组、模型组、对照组、针刺组，每组12只。除空白组外，其他组均造模处理。应用卵清蛋白吸入致敏激发法建立哮喘小鼠模型。第0和14天给予每只小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL，第24、25、26天将小鼠置于20 cm×40 cm×50 cm自制密闭容器中，每日雾化吸入l% OVA溶液10 mL，连续7 d，构建小鼠哮喘模型。

1.4 干预方法

针刺组从第27天开始取穴肺俞（双侧）、风门（双侧）、孔最（双侧）、鱼际（双侧），定位参照《实验针灸学实验指导》。结合小鼠解剖特点，肺俞为第3胸椎下两旁肋间；风门为第2胸椎下两旁肋间；孔最为前臂掌面桡侧腕横纹上第7个等分点处；鱼际穴为第1掌骨上大鱼际隆起的桡侧中点处。分别直刺6、6、5、2 mm，均采用平补平泻手法，每次20 min。每日1次，连续7 d。对照组予铁死亡诱导剂RSL3以10 mg/kg给药剂量灌胃，每日1次，连续7 d。空白组和模型组不做任何干预。空白组和模型组不做任何干预。

1.5 标本收集

末次干预24 h内眼球放血处死小鼠，分离完整气管和肺组织，左肺行支气管肺泡灌洗，0.5 mL磷酸缓冲盐溶液（PBS）灌洗2次，4 ℃下以4 000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，弃去BALF上清液得到细胞沉淀，加入RPMI 1640细胞培养基重悬后种板干预。免疫磁珠法分选EOS，每10个细胞添加20 μL的Siglec-F磁珠抗体，混匀后4 ℃冰箱孵育20 min。电泳缓冲液（Running Buffer）重悬细胞沉淀，4 ℃下以4 000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，去上清重复2次。设磁珠富集的磁柱进行阴选富集，1 500 μL Running Buffer缓冲液清洗未标记细胞后得到纯化EOS悬液。

气管插管灌注10%中性甲醛使左肺膨胀（内固定），摘除左肺浸入10%中性甲醛中（外固定），固定48 h后沿左肺门处斜形切取肺叶约2 mm，经乙醇脱水，石蜡包埋后制成切片行苏木精-伊红（HE）染色。

1.6 观察指标 1.6.1 小鼠肺组织病理学分析及气道炎症评分

观察小鼠支气管和肺泡周围炎性细胞浸润和结构改变情况。HE染色下选择长短径比≥0.6的完整气道，采用半定量法进行气道炎症评分。炎症评分标准为0分：无炎症细胞浸润；1分：少量炎症细胞浸润；2分：1层炎症细胞浸润，不均匀分布或成环形；3分：2 ~4层炎症细胞浸润气道，大量均匀分布或少量聚集成团；4分：4层及以上炎症细胞浸润气道，大量炎细胞聚集成团。

1.6.2 细胞Fe²⁺含量检测

收集细胞弃上清液后充分裂解，以3 000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm。按试剂盒说明书采用酶标仪于593 nm处测定各孔吸光度，根据公式计算细胞铁浓度。

1.6.3 DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平

收集细胞重悬于浓度为10 μmol/L的DCFHDA中，37 ℃孵育20 min，使探针和细胞充分接触，PBS洗涤2次，弃去DCFH-DA稀释液，流式细胞仪检测ROS表达强度。

1.6.4 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测MDA、GSH含量

收集细胞以3 000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，取上清液提取总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒测定上清液中蛋白浓度。按说明书采用酶标仪分别于532、410 nm处测定MDA及GSH水平。

1.6.5 肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-13水平

收集BALF，4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，离心半径为16 cm，离心后取上清液，按ELISA试剂说明书操作，测定BALF中IL-4、IL-13水平。

1.6.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测NCOA4、FTH1、GPX4蛋白表达

收集细胞置于RIPA裂解液裂解20 min，4 ℃下12 000 r/min离心20 min，离心半径为10 cm，提取组织总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒行蛋白定量。加入5×上样缓冲液，95 ℃变性10 min。SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，脱脂牛奶室温封闭1 h。加入一抗（NCOA4，1∶1 000；FTH1，1∶1 000；GPX4，1∶2 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶5 000）室温下孵育2 h。增强化学发光（ECL）显影，Image J软件灰度分析。

1.6.7 RT-PCR法检测NCOA4、FTH1、GPX4 mRNA表达水平

收集细胞后使用Trizol提取组织总RNA，NanaDrop分光度计检测总RNA浓度和纯度，按试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA进行PCR扩增。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0数据分析，计量资料满足正态分布以均数±标准差（x±s）表示。方差齐时组间比较选择单因素方差分析，两两比较采用LSD法。方差不齐者多组间采用Welch检验，组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组小鼠肺组织病理形态变化

空白组小鼠肺组织结构清晰，气管黏膜完整，无充血水肿等炎性改变；模型组小鼠肺泡壁断裂，肺泡塌陷变形，气管壁周围充血水肿伴炎细胞浸润；与模型组比较，对照组病理损伤有所改善，炎症细胞浸润减少，仍可见部分肺泡壁断裂、管壁增生；针刺组病理损伤明显减轻，仅可见少量炎性细胞浸润，部分肺间质充血水肿。见图 1。

2.2 各组小鼠气道炎症评分和BALF中IL-4、IL- 13水平比较

与空白组比较，模型组小鼠气道炎症评分升高，BALF中IL-4、IL-13含量升高（P < 0.01）；与模型组比较，对照组和针刺组小鼠气道炎症评分较前下降，BALF中IL-4、IL-13含量降低（P < 0.01）；与对照组相比，针刺组小鼠气道炎症评分降低，BALF中IL-4、IL-13含量降低（P < 0.01）。见图 2。

2.3 各组小鼠嗜酸粒细胞Fe²⁺、GSH、MDA含量和ROS水平比较

与空白组比较，模型组小鼠嗜酸粒细胞中Fe²⁺、MDA含量和ROS水平降低，GSH升高（P < 0.01）；与模型组比较，对照组和针刺组小鼠Fe²⁺、MDA含量和ROS水平升高，GSH含量降低（P < 0.01）；与对照组比较，针刺组小鼠Fe²⁺、MDA含量和ROS水平升高，GSH含量降低（P < 0.01）。见图 3。

2.4 各组小鼠EOS中NCOA4、FTH1、GPX4蛋白表达水平比较

与空白组比较，模型组小鼠EOS中NCOA4蛋白表达水平降低，FTH1、GPX4蛋白表达水平升高（P < 0.01）；与模型组比较，对照组和针刺组小鼠NCOA4蛋白表达水平升高（P < 0.01），FTH1、GPX4蛋白表达水平降低（P < 0.01）；与对照组比较，针刺组小鼠NCOA4蛋白表达水平升高（P < 0.01），FTH1、GPX4蛋白表达降低（P < 0.01）。见图 4。

2.5 各组小鼠EOS中NCOA4、FTH1、GPX4 mRNA表达比较

与空白组比较，模型组小鼠EOS中NCOA4 mRNA表达水平降低，FTH1、GPX4 mRNA表达水平升高（P < 0.01）；与模型组比较，对照组和针刺组小鼠NCOA4 mRNA表达水平升高（P < 0.01），FTH1、GPX4 mRNA表达水平降低（P < 0.01）；与对照组比较，针刺组小鼠NCOA4 mRNA表达水平升高（P < 0.01），FTH1、GPX4 mRNA表达降低（P < 0.01）。见图 5。

3 讨论

哮喘在中医属“哮病”范畴，起病急促、速发速止，与风邪“善行数变”“风盛则挛急”等致病特点甚合^[8]。肺朝百脉，为多血之脏，肺络丰富窄细，瘀血乘肺，影响气血津液代谢，痰瘀胶结于肺络。因此，“风邪袭肺，肺络瘀滞”是哮喘主要证素特点。针刺治疗哮喘临床疗效确切，降低氧化应激损伤，调节铁代谢，改善免疫应答，减轻哮喘气道炎症^[9]。肺俞乃肺之精气转输流注、出入体表之所在，《针灸资生经》云：“凡有喘与哮者，为按肺俞，皆为谬刺肺俞，令灸而愈”。风门为风邪出入之门户，乃搜风要穴，可疏风解表，宣肺平喘。孔最为肺经郄穴，是气血深聚之处，具有宣肺平喘、活血通络之功，研究发现能调节肺部通气血流，减轻气道阻力^[10]。鱼际为肺经荥穴，针刺鱼际能改善肺部炎症病理变化，改善肺顺应性^[11]。四穴相配，引肺之经气下行，具有疏风宣肺，理气通络之功。本研究显示“疏风通络”配穴能小鼠气道炎性浸润减少、炎症评分下降，小鼠BALF中Th2型炎症因子IL-4、IL-13含量显著下降，提示针刺治疗能抑制诱发哮喘炎性细胞因子释放，减少气道炎性浸润。

哮喘是一种复杂的慢性气道炎症性疾病，伴随气道高反应性与气道重塑等特征性表现。气道炎症是哮喘病理改变的核心环节。EOS是最重要的炎症效应细胞，是气道炎症进程的主要参与者。EOS清除率下降，生存周期延长，在炎症部位大量积聚并持续激活，使炎症反应进行性加重^[12-13]。EOS在所有炎症细胞中Fe²⁺含量最高，EOS的高铁含量贮备使其较其他细胞更易于发生铁死亡^[14]。2020年沈华浩团队首次在Thorax报道靶向诱导EOS铁死亡能有效缓解哮喘嗜酸性气道炎症，与糖皮质激素（GCs）在减轻气道炎症中存在良好协同作用^[3]。

铁死亡是一种以铁依赖和脂质过氧化物堆积为核心特点的新型细胞死亡方式，具有独特的触发因素和调节机制^[15-16]。铁死亡的核心机制在于GSH耗竭，GPX4是一种硒依赖的抗氧化酶，是铁死亡最重要的防御基因，利用GSH将脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇，GPX4表达活性降低，脂质过氧化物积累，细胞抗氧化应激能力下降，诱导细胞铁死亡。游离Fe²⁺激活芬顿反应释放ROS，过量ROS驱动细胞脂质过氧化，分解为一系列复杂的化合物，如MDA、SOD等，触发细胞铁死亡。因此，维持细胞铁稳态在调控铁死亡中起关键作用^[17-19]。本研究采用免疫磁珠法分选小鼠EOS，模型组OVA哮喘小鼠肺泡塌陷变形，气管壁周围充血水肿，Fe²⁺含量下降，氧化应激水平下降，GSH、GPX4蛋白活性升高，提示存在细胞铁死亡水平下降导致EOS过度积累。针刺“疏风通络”配穴干预后，与对照组比较，针刺组小鼠嗜酸粒细胞Fe²⁺含量明显升高，氧化还原标志物MDA、ROS水平升高，GSH含量明显下降，GPX4蛋白表达降低，提示针刺治疗通过促进Fe²⁺蓄积和降低抗氧化水平诱导EOS铁死亡，改善气道炎症水平。

随着研究深入，更多研究支持铁死亡是一种自噬依赖性的细胞死亡方式^[20]。2014年Mancias等首次提出铁自噬（ferritinophagy）概念，自噬溶酶体特异性介导铁蛋白降解并释放游离铁，以调控细胞内铁含量的选择性自噬方式，成为诱导铁死亡的上游机制^[21]。NCOA4作为介导铁自噬的特异性受体，翻译后水平受到细胞内铁含量严格调控^[22]。Das等^[5]报道NCOA4过度表达激活铁自噬，降解细胞内铁蛋白，增加游离铁浓度，促进细胞铁死亡。FTH1是胞内主要储铁蛋白复合物，NCOA4有效识别FTH1，将其转运到溶酶体内以自噬方式被降解，释放铁离子^[23]。NCOA4表达增加，NCOA4-FTH1相互作用增强，通过调控游离铁浓度增加细胞对铁死亡敏感性，过多游离铁通过芬顿反应产生大量ROS，脂质过氧化物堆积增加，氧化应激失衡加剧，GPX4等脂质代谢酶活性降低，导致细胞铁死亡发生^[24-26]。本研究选取铁自噬标志蛋白NCOA4和FTH1，模型组哮喘小鼠EOS中NCOA4 mRNA和蛋白表达下降，FTH1 mRNA和蛋白表达升高，细胞铁自噬水平下降。针刺“疏风通络”配穴干预后，与对照组比较，针刺组小鼠EOS中NCOA4 mRNA和蛋白表达升高，FTH1 mRNA和蛋白表达降低，同时伴随细胞铁水平及氧化应激水平升高，脂质代谢酶GPX4活性下降，提示针刺治疗通过NCOA4介导的铁自噬被激活，铁稳态破坏，加剧脂质过氧化物堆积和氧化应激失衡，促进其介导的EOS铁自噬-铁死亡发生。见图 6。

综上，针刺“疏风通络”配穴治疗能改善哮喘气道炎症，在哮喘防治中疗效显著，其机制可能通过调控NCOA4-FTH1通路介导的铁自噬，诱导EOS铁死亡途径实现。