结直肠癌中大约30%是直肠癌。在中国，直肠癌患者占比较高^[1]。直肠癌的发生与不可改变的风险因素有关，包括年龄和遗传因素，以及与环境和生活方式相关的可改变因素^[2]。直肠癌常规疗法包括手术、化疗和靶向治疗。目前的化疗药物可以治疗直肠癌，但会引起不良反应和耐药性。穿心莲是是苦寒清解的经典中药，用于治疗温热病、咽喉肿痛及湿热泻痢等症。现代研究发现，其提取物穿心莲内酯具有抗病毒、抗炎、免疫调节的作用。近年来，研究发现穿心莲内酯在抗肿瘤、保护心脑血管等领域也显示出潜力，其抗炎与免疫调节特性尤其与肿瘤微环境及化疗增敏密切相关，在癌症中能够作为免疫调节剂或免疫刺激剂发挥作用^[3]。然而，其在逆转直肠癌5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药方面的作用与机制尚属空白。据报道，穿心莲内酯可能通过靶向锌-α2-糖蛋白1（AZGP1）影响直肠癌的放射耐药性，穿心莲内酯和AZGP1干预的联合治疗可能是提高直肠癌放疗效果的一种潜在方法^[4]。但相关分子机制尚未阐明。Hedgehog通路（HH通路）在调节细胞分化、组织器官发育和肿瘤发生方面起着重要作用。其中，声波刺猬（SHH）可直接调节GLI家族锌指蛋白（GLI1）的表达^[5]。研究发现，在胰腺癌中沉默谷胱甘肽合成酶（GSH2）通过激活SHH/GLI1通路来缓解吉西他滨耐药性^[6]。本研究基于穿心莲内酯已知的抗炎、免疫调节及初步抗肿瘤活性，并结合SHH/GLI1信号通路在维持肿瘤干细胞特性及化疗耐药中的关键作用，初步探讨穿心莲内酯对5-FU耐药直肠癌细胞的作用及机制，为临床联合用药提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

人直肠癌耐药细胞株SW20/5-FU（JC-CC0195）购买于上海机纯实业有限公司；穿心莲内酯（YT0289）购自北京伊塔生物科技有限公司；SHH信号通路抑制剂Cyclopamine（CS-01Y64738）购自上海莼试生物技术有限公司；兔抗细胞周期蛋白D1（CyclinD1，BM4272）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2，A00286）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9，PB0709）、SHH（BA2171）、GLI1（A00527-3）、神经钙黏蛋白（N-Cadherin，BM3921）、波形蛋白（Vimentin，BM4029）、上皮性黏附蛋白（E-Cadherin，BM3903）、β-肌动蛋白（β-actin，BA2305）抗体购买于博士德生物公司。

1.2 方法 1.2.1 细胞鉴定、处理和分组

将SW20和SW20/5-FU接种在96孔板，用一系列浓度梯度的5-FU处理细胞48 h，每个浓度设置多个复孔，并设置不加细胞的空白组，加细胞计数试剂盒-8（CCK-8）孵育后，检测450 nm的光密度值（OD值），计算细胞存活率，存活率（%）=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%，计算耐药指数（RI），RI=IC₅₀（SW20/5-FU细胞）/IC₅₀（SW20细胞），RI>1表示细胞存在耐药性。

将SW20/5-FU细胞培养至对数期。用不同浓度穿心莲内酯（3.75、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 μmol/L）分别处理SW20/5-FU细胞24、48、72 h，检测细胞活力，筛选后续实验中的穿心莲内酯浓度和处理时间。

将SW20/5-FU细胞分为对照组（Control组）、穿心莲内酯低浓度组（AND-L组）、中浓度组（AND-M组）、高浓度组（AND-H组）、穿心莲内酯高浓度+SHH信号通路抑制剂组（Cyclopamine组），穿心莲内酯使用15.0、30.0、60.0 μmol/L的浓度处理SW20/5-FU细胞24 h，Cyclopamine组用60.0 μmol/L的穿心莲内酯和3.0 μmol/L的Cyclopamine^[7]共同处理SW20/5-FU细胞24 h，Control组不作任何处理。

1.2.2 细胞增殖

培养细胞至克隆出现时终止培养，磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗，加甲醇孵育，结晶紫染色，PBS冲洗，显微镜拍照，统计克隆形成数。

1.2.3 细胞迁移

将SW20/5-FU细胞调整浓度约为1×10⁵个/mL，接种6孔板。无菌移液器枪头垂直划痕，每孔加血清培养基，培养划痕融合，收集细胞，拍照，计算划痕愈合率。

1.2.4 细胞侵袭

用基质胶涂抹小室底部，进行包被，待其凝固，将SW20/5-FU细胞制备为细胞悬液，加入小室内，培养24 h，PBS清洗，多聚甲醛固定，结晶紫染色。显微镜观察，统计侵袭细胞数目。

1.2.5 蛋白表达

收集细胞，提取各组SW20/5-FU细胞总蛋白，取蛋白上样，通过电泳、转膜、封闭处理后，加CyclinD1、MMP-2、MMP-9、SHH、GLI1、N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin、β-actin一抗稀释液，过夜孵育，加二抗稀释液，孵育，增强型化学发光试剂（ECL）显色，曝光，将β-actin作为内参蛋白，分析各蛋白的相对表达量，比较各组间统计学差异。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 穿心莲内酯浓度筛选

采用穿心莲内酯（浓度为3.75~120.0 μmol/L）分别干预SW20/5-FU细胞24、48、72 h，当处理时间为24 h且浓度在15.0 μmol/L以上时，SW20/5-FU细胞的增殖活力显著降低，因此选择穿心莲内酯浓度为15.0、30.0、60.0 μmol/L用于后续实验浓度，见表 1。

2.2 穿心莲内酯对直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

与Control组比较，AND-L、AND-M、AND-H组细胞增殖、迁移、侵袭能力减弱，细胞增殖和侵袭数目减少，迁移宽度缩小，细胞克隆形成数、划痕愈合率、侵袭数量降低（P < 0.05）；与AND-H组比较，Cyclopamine组细胞增殖、迁移、侵袭能力增强，细胞增殖和侵袭数目增加，迁移宽度增加，克隆形成数、划痕愈合率、侵袭数量上升（P < 0.05），见图 1-3、表 2。

2.3 穿心莲内酯对直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

与Control组比较，AND-L、AND-M、AND-H组CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平下降（P < 0.05）；与AND-H组比较，Cyclopamine组CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平升高（P < 0.05），见图 4、表 3。

2.4 穿心莲内酯对直肠癌细胞上皮间质转化（EMT）影响

与Control组比较，AND-L、AND-M、AND-H组N-Cadherin、Vimentin表达水平降低，E-Cadherin蛋白表达水平升高（P < 0.05）；与AND-H组比较，Cyclopamine组N-Cadherin、Vimentin蛋白表达水平上升，E-Cadherin蛋白表达水平降低（P < 0.05），见图 5、表 4。

2.5 穿心莲内酯对SHH/GLI1信号通路的影响

与Control组比较，AND-L、AND-M、AND-H组SHH、GLI1表达水平升高（P < 0.05）；与AND-H组比较，Cyclopamine组SHH、GLI1表达水平降低（P < 0.05），见图 6、表 5。

3 讨论

术后放化疗通常用于局部晚期直肠癌患者；然而，功效因人而异^[8]。治疗直肠癌常用的药物，在化疗初期有效，而其中一些药物不可避免地会随着反复的治疗周期而产生耐药性^[9]。因此，在直肠癌研究中，寻找新的抗耐药性药物对预后尤为重要。

化疗是转移性直肠癌（mRC）的标准治疗方法。细胞毒性化疗药物5-FU、卡培他滨、奥沙利铂和伊立替康（IRI）与表皮生长因子受体或血管内皮生长因子拮抗剂联合使用，构成mRC的主要治疗药物。然而，如果由于耐药导致治疗失败，则预后较差^[10]。5-FU通常用于晚期或无法手术的mRC患者。据报道，其作为原发性结肠肿瘤的一线化疗和转移性癌症的姑息性化疗均具有有益的结果。克服5-FU耐药的策略是增加5-FU的剂量或将其与其他抗癌药物联合使用。增加5-FU的剂量会加重不良反应，包括骨髓抑制、腹泻、恶心和呕吐等一般症状^[11]。化疗耐药是一个复杂过程，表现为关键生长调节基因表达失调和相关通路中细胞信号传导的改变。对一线治疗的获得性耐药性往往会带来后续治疗的耐药性，从而导致多药耐药性（MDR）。本研究中，人直肠癌耐药细胞株SW20/5-FU对化疗药物5-FU耐药，因此作为本研究的实验对象进行研究。

穿心莲内酯是一种C20二萜内酯，是一种源自传统中草药穿心莲的活性成分。穿心莲能够在血液中循环，具有多种生物活性，如抗炎、抗病毒和免疫调节作用，广泛用于治疗喉咙痛、发烧、腹泻和包括结肠炎在内的炎症性疾病^[12]。此外，研究表明，穿心莲在多种恶性肿瘤中具有抗致癌特性，如黑色素瘤、白血病、胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、直肠癌、膀胱癌、胰腺癌和肝癌。其潜在机制包括调节氧化应激、凋亡、坏死、自噬、抑制细胞黏附、增殖、迁移、侵袭和血管生成^[13]。研究发现，穿心莲内酯通过靶向参与直肠癌迁移和侵袭的枢纽基因抑制细胞增殖、迁移和生长，诱导细胞凋亡^[14]。研究证实，穿心莲内酯通过抑制结直肠癌细胞（HCT116细胞）中的磷酸肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路下调糖酵解来增强放射敏感性^[15]。本研究中，通过使用穿心莲内酯（15.0、30.0、60.0 μmol/L）分别处理SW20/5-FU细胞，发现SW20/5-FU细胞克隆形成数、划痕愈合率、细胞侵袭数量降低，并且增殖、迁移、侵袭、EMT相关蛋白CyclinD1、MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin表达水平下降，E-Cadherin表达升高，提示穿心莲内酯能够抑制直肠癌耐药细胞的增殖、迁移、侵袭行为，在直肠癌中发挥抗肿瘤作用，也抑制了直肠癌的化疗耐药性。

HH信号通路是跨各种物种的保守通路，在成人胚胎发育和组织形态发生过程中起着关键作用。在人类中，HH通路由HH配体、两个跨膜蛋白受体以及GLI组成。在经典的HH通路中，当HH配体缺失时，膜受体蛋白patched（Ptch）抑制跨膜蛋白（Smo）活性，从而抑制GLI的裂解，阻断HH通路的激活。当HH配体存在时，与Ptch结合，解除Smo抑制并导致GLI转录因子的激活。激活的GLI易位到细胞核，随后调节GLI靶基因的转录。在许多人类恶性肿瘤中已检测到SHH通路的异位激活^[16]。研究发现，姜黄素通过GLI1-β-连环蛋白（β-catenin）通路在胃癌SGC-7901细胞中发挥抗肿瘤作用^[17]。研究证实，姜黄素类似物（BDDD-721）通过靶向SHH/GLI1信号通路，对髓母细胞瘤具有比姜黄素更有效的抗癌作用^[18]。本研究观察到一个值得深入探讨的现象，穿心莲内酯处理后的SW20/5-FU细胞中，SHH、GLI1表达水平随着浓度的升高而上升，说明穿心莲内酯能够激活SHH/GLI1蛋白活性，促进SHH/GLI1通路蛋白表达。这与该通路通常促肿瘤的经典认知似乎相悖，推测这可能是一种“过度激活诱导的负反馈或细胞应激反应”。在某些情况下，强烈或持续的通路刺激可能超出肿瘤细胞的承受阈值，转而激活凋亡程序、诱导生长停滞或触发内质网应激。因此，穿心莲内酯可能通过一种“特殊”的激活方式，将SHH/GLI1通路从促生存信号转变为促死亡信号。本研究同时使用SHH通路抑制剂Cyclopamine处理高浓度穿心莲内酯处理后的SW20/5-FU细胞，发现穿心莲内酯的抗肿瘤作用发生了逆转，验证了穿心莲内酯可能通过SHH/GLI1通路抑制直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT行为，降低了直肠癌细胞的化疗耐药性。虽然本研究通过抑制剂进行了反向的验证，且证明了抑制剂能反向逆转CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平，但未有直接证据证明CyclinD1、MMP-2、MMP-9是受GLI1直接调控的，这也是本研究的局限性，也是后续研究中需要完善的重点，未来可以通过免疫共沉淀、双荧光素酶以及过表达或敲除实验对这一猜想进行验证。

综上，本研究首次发现，穿心莲内酯可能具有抑制直肠癌的活性和耐药的作用，能显著抑制SW20/5-FU细胞的增殖、迁移和侵袭活力，诱导其凋亡，并下调EMT以及SHH、GLI1等关键通路的蛋白表达水平。以上研究结果验证了提出的科学假设，提示穿心莲内酯有望成为一种潜在的5-FU化疗增敏剂，为临床逆转直肠癌化疗耐药提供了新的候选策略和实验依据。本研究还存在一些不足之处，仅通过体外实验使用耐药细胞进行研究，未设置阳性对照，对穿心莲内酯的药物作用还需进一步研究；其次，未开展体内实验研究，并且对SHH/GLI1信号通路的上下游靶点未进行深入研究，因此，在后续研究中，本课题组将针对以上问题开展实验，从而对穿心莲内酯在直肠癌中的抗化疗耐药作用进一步完善。