急性高原病（AMS）是人群快速进入高原或更高海拔地区时，因未能良好习服低压低氧环境而出现的临床综合征，包括急性高原反应、高原脑水肿和高原肺水肿等，主要涉及神经、呼吸及心血管系统^[1]。其特点是发病急、病程短、病死率高，若不及时救治可危及生命。目前，西医对AMS的首选措施是氧疗，但其依赖大型设备、不便携且无预防作用。药物治疗方面，乙酰唑胺虽被普遍认可，但其对快速急进高原人员的疗效有限，且毒副作用明显^[2]，尤其不适用于部队战士。其他用于治疗高原肺水肿和高原脑水肿的对症药物（如钙通道阻滞剂、甘露醇、利尿剂及激素等）同样缺乏预防保护作用。

近年来，中药在高原缺氧预防研究中展现出潜力。黄芪、红景天、蕨麻等天然药物已被证实具有抗高原缺氧作用^[3-4]。然而，现有研究多集中于中药单体或单味药，作用相对单一，不符合中医“辨证论治”的原则虽有针对高原病的复方制剂（如复方党参片）在研，但尚未在临床AMS治疗中广泛应用。而临床常用的复方丹参滴丸侧重于活血化瘀，未能充分针对高原缺氧“气虚”的核心病机，未能体现“虚则补之”的治疗法则。中医认为AMS的治则应为补气养血、活血通脉。在此理论指导下，抗缺氧中成药芪参益气滴丸显示出明确价值^[5]。其常压下抗缺氧作用已获证实，且方中君药黄芪及臣药三七、丹参在急慢性高原病防治中均有应用基础^[6-8]。初步研究表明芪参益气滴丸可减轻大鼠高原脑水肿^[9]，但其在高原低压缺氧环境下对AMS多器官的保护作用及机制尚不明确。

因此，为进一步验证芪参益气滴丸防治AMS的有效性并深入探索其机制，本研究通过建立AMS大鼠模型，评估芪参益气滴丸对多脏器的保护作用，并重点探究其对水通道蛋白4（AQP4）和低氧诱导因子-1α（HIF-1α）/血管内皮细胞生长因子（VEGF）信号通路的影响。本研究旨在为芪参益气滴丸防治AMS提供新的作用靶点和理论支撑。

1 材料 1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量230~250 g，由中国食品药品检定研究院（北京大兴）提供，动物许可证编号：SCXK（京）2022-0002。实验动物分笼饲养，每笼6只，自由摄食和水，适应性喂养1周。动物实验遵循天津中医药大学伦理委员会指导，伦理审批号：TCM-LAEC2024151w1606。

1.2 药品试剂

芪参益气滴丸购自天士力医药集团股份有限公司；红景天胶囊来源于中国人民解放军西藏军区总医院；伊文思蓝购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；总超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；VEGFR2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、AQP4等抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 实验仪器

DSF580-I动物实验舱（潍坊华信氧业有限公司）；动物肺功能检测系统（上海塔望科技公司）；Vevo小动物超声成像系统（加拿大VisualSonics公司）；凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD公司）。

2 方法 2.1 大鼠急性高原病模型制备、分组及给药

将大鼠随机分为6组：正常对照组（Control组）、缺氧模型组（HHM组）、芪参益气滴丸低剂量组（QSYQ-L组，46 mg/kg）、芪参益气滴丸中剂量组（QSYQ-M组，92 mg/kg）、芪参益气滴丸高剂量组（QSYQ-H组，138 mg/kg）和红景天胶囊组（RR组，28 mg/kg），每组6只，适应饲养7 d后开始实验。给药剂量根据参考文献^[10]以及预实验所得。用羧甲基纤维素钠配制芪参益气滴丸和红景天胶囊溶液，预防性灌胃给药7 d，正常对照组和模型组给与相同溶媒，将大鼠放入低压氧舱中，调节仪器参数，调整海拔高度为8 000 m，时间设定为48 h，高度上升速率为20 m/s，下降速率为10 m/s，温度为10 ℃。

2.2 脑、肺湿干比率测定

各组实验动物麻醉后剪开胸腔，分离肺、脑，将左肺与左脑剪下，用干净的滤纸吸干残留表面的血液，精密称量质量（记为湿质量，W）。称量质量后将其放进110 ℃电热鼓风干燥箱，后续每隔12 h再次称量直到质量不再变化为止（记为干质量，D）。计算湿干比率（W/D）。

2.3 心功能评定

用VisualSonics小动物超声成像系统（Vevo 2000 System）对大鼠的心脏功能进行检测。将大鼠胸部皮毛剃去，涂抹适量的耦合剂，探头垂直放至胸部，获得胸骨旁长轴视图，将M超测量线放在乳头肌后缘，按下B-Mode按钮，获取B-mode图像。随后进行计算，连续测量3次，得到射血分数（EF）。

2.4 肺功能评定

利用肺功能仪对大鼠进行肺功能检测。本实验使用全身体积描记系统，同时监测12只大鼠的吸气时间（Ti）、呼气时间（Te）、潮气量（TV）、吸气流峰值（PIF）、呼气流峰值（PEF）、呼吸频率（BR）等肺功能。检查装置的气密性，确保装置密闭，将体积动物描记箱与通风泵连接，流量计调整为1 LPM，以保证腔体内有足够氧气让大鼠呼吸。将大鼠放入描记箱中，对大鼠进行20 min的呼吸信号采集。

2.5 血脑屏障通透性检测

基于渗出血管的伊文思蓝染料（EB）含量，评估大鼠脑组织血脑屏障通透性。将大鼠麻醉后，通过股静脉注射2%含量的EB溶液（2 mL/kg），40 min后大鼠眼球变蓝提示注射成功。称取脑组织100 mg，加入3 mL甲酰胺，研磨组织，恒温孵育，5 000 r/min离心15 min，离心半径6 cm取上清液，在620 nm处测定OD值。根据EB标准曲线计算样本的EB含量，最终以每个组织内所含EB的量（μg）表示血脑屏障对EB的通透性。

2.6 MDA含量及SOD活力测定

采用腹主动脉取血法，血液静置2 h后3 000 r/min离心10 min，放入-80 ℃冰箱保存。按照试剂盒说明书检测大鼠血清中MDA含量以及SOD活力。

2.7 苏木精-伊红（HE）染色

将制备好的大鼠脑、肺组织切片（5 μm）烘箱烤30 min后，在二甲苯中脱蜡处理，经梯度乙醇脱去二甲苯，蒸馏水水洗。切片用苏木精试剂染色5 min，0.5%盐酸乙醇分化20 s，0.1% ~ 0.5%伊红试剂染色2 min。染色后用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片镜检观察。

2.8 免疫组织化学染色检测AQP4表达

脑、肺组织切片脱蜡水化后，3% H2O2孵育30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，微波法在枸橼酸钠缓冲液中进行抗原修复20 min，冷却后PBS清洗，滴加山羊血清封闭切片，室温孵育20 min，滴加AQP4一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后，滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（1∶200），室温孵育30 min，PBS清洗，DAB显色，脱水透明，中性树胶封片，显微镜拍照，用Image J图像分析软件进行量化分析。

2.9 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测HIF-1α和VEGFR2蛋白表达

收集脑和肺组织，用RAPI裂解液充分裂解。将样品在4 ℃ 12 000 g离心20 min，收集上清液，BCA法测定总蛋白。蛋白变性后在8%或10% SDS-PAGE凝胶上电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。样品用5%脱脂牛奶封闭2 h，用TBST缓冲液洗涤3次。将HIF-1α、VEGFR2抗体用TBST按照说明书进行适当比例的稀释，4 ℃过夜孵育。用TBST洗涤后加入二抗（山羊抗兔，1∶20 000），室温孵育2 h。TBST洗涤后，加入ECL发光液，使用凝胶成像仪显影。计算各蛋白相对表达量。

2.10 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件作图并对数据进行统计分析，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，使用单因素方差分析（One-way ANOVA），P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 芪参益气滴丸对脑、肺组织湿干比率的影响

与Control组相比，HHM组脑湿干比率显著性增大（P < 0.05），表现明显水肿；与HHM组相比，QSYQ-L组、QSYQ-M组和RR组的脑湿干比率明显减小（P < 0.05）。HHM组肺湿干比率明显增大（P < 0.05）；与HHM组比较，QSYQ-L组、QSYQ-M组、QSYQ-H组和RR组的肺湿干比率均显著减小（P < 0.05）。提示芪参益气滴丸可以降低大鼠脑、肺组织湿干比率。见图 1。

3.2 芪参益气滴丸对心脏收缩功能的影响

大鼠心脏超声检测结果中，每张图像上方为B-mode图像，下方为M-mode图像。与Control组相比，HHM组室壁运动减小，心室腔增大；治疗组（QSYQ-L、QSYQ-M、QSYQ-H和RR）较HHM组室壁运动增加，收缩力增强，见图 2A。各组EF指标中，HHM组EF明显小于Control组（P < 0.01）；与HHM组相比，QSYQ-L、QSYQ-M、QSYQ-H和RR 4组EF值均显著升高（P < 0.01），提示QSYQ能够增强心脏收缩功能，对AMS大鼠心脏具有保护作用，见图 2B。

3.3 芪参益气滴丸对肺功能的影响

与Control组比较，HHM组Ti和Te显著延长（P < 0.05）；与HHM组比较，芪参益气滴丸各组与RR组均能显著降低Ti，QSYQ-L组显著性减少Te（P < 0.05）。与Control组相比，HHM组TV、PIF、PEF和BR显著降低（P < 0.05）；与HHM组比较，QSYQ-L组明显提高TV、PIF、PEF和BR，RR组明显提高TV和PEF（P < 0.05）。提示芪参益气滴丸能够有效改善大鼠肺功能。见图 3。

3.4 芪参益气滴丸对血脑屏障的影响

与Control组相比，HHM组EB含量显著升高（P < 0.01），经过芪参益气滴丸与红景天胶囊干预防治后，其EB含量明显降低（P < 0.05）。实验结果显示，芪参益气滴丸能够有效降低AMS大鼠血脑屏障通透性。见图 4。

3.5 芪参益气滴丸对血清中MDA及SOD的影响

与Control组比较，HHM组血清中MDA含量显著增多（P < 0.01），SOD活力显著降低（P < 0.05），MDA含量增加了60.65%，SOD活力降低了18.41%；与HHM组比较，芪参益气滴丸各剂量组以及RR组MDA明显降低（P < 0.05），QSYQ-M组和RR组SOD活力明显增加（P < 0.05）。结果提示，芪参益气滴丸能改善AMS大鼠氧化应激损伤。见图 5。

3.6 芪参益气滴丸对心脑肺组织病理形态学的影响

光镜下不同分组大鼠心肌组织切片中可以观察到其心肌细胞排列整齐，呈现出典型的横纹状结构，未见炎性细胞浸润等病理改变，见图 6A。在图 6B中箭头处，HHM组大鼠可见脑组织内神经细胞水肿，细胞间隔增大，核固缩；经过芪参益气滴丸与红景天胶囊防治后，脑组织水肿明显改善。在图 6C中箭头处，HHM组大鼠肺组织充血、水肿，出现肺泡壁增厚，肺泡腔缩小并存在红细胞及粉红色蛋白物质，伴有炎细胞浸润；经过芪参益气滴丸与红景天胶囊干预后，大鼠肺泡结构趋于完整，肺泡壁变薄，肺泡腔内渗出减少甚至消失，炎细胞减少。上述结果提示，芪参益气滴丸能改善AMS大鼠脑、肺组织病理学改变。

3.7 芪参益气滴丸对脑组织、肺组织中AQP4蛋白表达的影响

AQP4蛋白主要在Control组大鼠皮质、皮质下白质及纹状体区的毛细血管壁、胶质细胞的胞膜表达。低压低氧诱导后，AQP4蛋白在皮质表达量增加，与Control组比较差异有统计学意义（P < 0.05），经过芪参益气滴丸与红景天胶囊干预后，表达明显降低（P < 0.01）。AQP4蛋白主要表达在Control组大鼠肺微血管内皮细胞及肺泡上皮细胞，但血管内皮细胞表达强于肺泡上皮。低压低氧诱导后，AQP4蛋白在皮质表达量增加（P < 0.01），经过芪参益气滴丸干预后，QSYQ-M组和QSYQ-H组显著降低（P < 0.05）。结果表明，芪参益气滴丸能降低AMS大鼠脑、肺组织AQP4蛋白表达。见图 7。

3.8 芪参益气滴丸对脑、肺组织HIF-1α和VEGFR2蛋白表达的影响

与Control组比较，HHM组脑组织HIF-1α表达明显升高（P < 0.05）；与HHM组比较，QSYQ-L组和QSYQ-H组表达则显著降低（P < 0.05），见图 8A。与Control组比较，HHM组肺组织HIF-1α表达显著升高（P < 0.05）；与HHM组比较，QSYQ-H组与RR组表达量明显下降（P < 0.05），见图 8B。与Control组比较，HHM组脑组织VEGFR2表达显著升高（P < 0.01）；与HHM组比较，QSYQ-L组、QSYQ-H组与RR组表达显著性降低（P < 0.05），见图 8C。与Control组比较，HHM组肺组织VEGFR2表达升高（P < 0.05）；与HHM组比较，QSYQ-L组、QSYQ-H组表达量显著降低（P < 0.05），见图 8D。以上结果表明芪参益气滴丸能够有效抑制AMS大鼠脑组织和肺组织HIF-1α和VEGFR2蛋白表达。

4 讨论

人群急进高原后，常因无法适应低压缺氧环境而出现一系列高原反应症状，严重者可发展为高原脑水肿和高原肺水肿，严重影响正常生活与行动^[11]。低压缺氧对中枢神经系统和呼吸系统的危害尤为突出。研究表明，低氧对人体中枢神经系统的影响更为严重^[12]。其机制涉及缺氧导致脑血流增加、氧化应激等，增加脑血管通透性，最终引发高原脑水肿^[13]。高原肺水肿的发病机制尚未完全阐明，目前认为低氧导致的肺血管收缩、肺毛细血管通透性升高、肺泡-毛细血管屏障破坏、肺泡液体清除能力减弱是引发高原肺水肿的主要因素^[14]。

本研究采用低压氧舱系统建立AMS大鼠模型，评价芪参益气滴丸对AMS大鼠所致多器官损伤的保护作用。组织含水量是评价脑、肺水肿的直接指标，与对照组相比，HHM组脑、肺组织含水量明显增加，证实急性低压缺氧可造成脑和肺组织水肿，与文献报道一致^[15]。与HHM组比较，芪参益气滴丸低、中、高剂量组、RR组均能显著降低低压缺氧所致AMS大鼠的脑、肺组织含水量。表明芪参益气滴丸对AMS大鼠脑、肺组织水肿具有防治作用。研究证实，低压缺氧会损伤心脏功能，特别是左室收缩功能^[16]，心脏超声检测显示，HHM组大鼠心脏EF明显降低，说明心脏收缩功能减弱，经芪参益气滴丸治疗后，大鼠心脏EF显著增加，这表明芪参益气滴丸能改善低压缺氧状态下心脏的收缩功能。

进入高原地区后，空气稀薄，密度降低，呼吸代偿性加深加快，使气流速度增加，而气流速度和气道阻力成正比，因此气道阻力增大^[17]。本研究发现，HHM组Ti、Te延长，PIF、PEF、TV降低，BR减慢，这些变化表明肺水肿导致呼吸道堵塞，吸气肌与呼气肌力量减弱，肺通气量不足，需要加快呼吸频率以确保足够的通气量。经芪参益气滴丸与红景天胶囊干预后，上述呼吸指标得到缓解。提示芪参益气滴丸能改善低压缺氧导致的呼吸功能障碍。血脑屏障能够调节物质运输并维持大脑内环境稳定^[18]。本研究结果证实，芪参益气滴丸能够减少脑组织EB含量，降低血脑屏障通透性，其作用可能与改善AMS大鼠脑水肿有关；红景天也表现出相似的药效，与文献报道结果一致^[19]。

急慢性低压缺氧暴露均会升高氧化应激生物标志物的水平，迅速触发氧化应激^[20]，损伤血管内皮细胞，引起血管内皮功能障碍，促进血管性疾病的发生发展^[21]。SOD是清除氧自由基最有效的酶，能使细胞免受氧化自由基的损伤。MDA是体内脂质过氧化作用产生的脂质过氧化物，它的含量与细胞损伤的程度呈正相关，也间接反映氧自由基的生成量^[22]。本实验结果证明，芪参益气滴丸可显著降低AMS大鼠血清MDA含量并提高SOD的活性。

病理学结果显示：模型组大鼠心肌细胞排列整齐，没有明显的病理改变；模型组大鼠脑组织内细胞间隔增大，核固缩，组织充血；肺组织充血、出现肺泡壁增厚，肺泡腔缩小并存在红细胞及粉红色蛋白物质，伴有炎细胞浸润；芪参益气滴丸各剂量组大鼠脑组织和肺组织损伤程度及水肿程度均明显减轻，说明芪参益气滴丸能够改善低压缺氧对大鼠脑和肺组织病理学损伤。

HIF-1α受缺氧信号的调控，参与保护机体免受氧化应激。在常氧条件下，HIF-1α受脯氨酰羟化酶（PHDs）降解调节，而在缺氧状态下，PHDs功能受抑制，导致HIF-1α在胞质中稳定并转位入核，与HIF-1β结合形成有活性的HIF-1，活化的HIF-1与靶基因上的缺氧反应元件结合，进而调节多种因子的转录，如AQP4、MMP-9、VEGF等^[13]。HIF-1α作为其上游基因能通过促进VEGF和AQP4的增加来共同导致脑水肿增加以及血脑屏障破坏^[23-24]。本研究检测了大鼠脑和肺组织AQP4、HIF-1α和VEGFR2蛋白的表达，结果表明，HHM组中AQP4、HIF-1α和VEGF蛋白表达明显升高，与文献报道一致^[13]。经芪参益气滴丸干预后，脑和肺组织中AQP4、HIF-1α和VEGF蛋白表达明显降低；这表明芪参益气滴丸可能通过有效抑制HIF-1α/VEGF和AQP4信号通路，从而发挥多脏器保护作用。

综上所述，芪参益气滴丸能够降低AMS大鼠脑、肺水肿程度，改善心肺功能，降低血脑屏障通透性，抑制氧化应激，改善低氧对脑、肺组织病理学损伤，芪参益气滴丸对AMS大鼠心、脑、肺器官损伤的保护作用，可能与调节HIF-1α/VEGF和AQP4通路有关。这一发现揭示了芪参益气滴丸通过多靶点干预缺氧损伤的新机制，为开发防治急性高原病特色中药制剂奠定了理论基础。