癌症恶病质是一种常见癌症并发症，其主要特征是骨骼肌质量的持续损失，且癌症恶病质难以通过传统营养治疗实现逆转^[1]。癌症恶病质的主要临床表现是非自愿的体质量减轻、厌食症、全身炎症、胰岛素抵抗以及静息能量消耗增加^[2]。癌症恶病质是一种影响多器官的综合征，对人体脂肪组织、免疫系统、骨骼肌、心肌、胃肠道等均有负面影响，往往导致癌症患者身体机能、耐受抗癌治疗的能力以及生存率下降^[3-4]。目前，癌症恶病质的治疗方法主要包括营养治疗、锻炼、补充omega-3脂肪酸，运用黄体酮类似物、糖皮质激素、炎症因子抑制剂、非甾体抗炎药、生长激素或饥饿素类似物、奥氮平等药物治疗^[5]，但是并没有针对癌症恶病质的靶向治疗方法或者标准化的护理方案^[6]。因此，找寻治疗癌症恶病质的有效药物，并对其作用机制进行探索，极具临床意义。

中医认为，“癌毒致虚”是癌症恶病质的核心病机，癌毒胶结体内阻碍人体精微生成输布，致脏腑肢体失养是其发生发展的重要机制。这一理论与西医中炎性微环境促进癌症恶病质发生发展的机制相对应^[7]。近期研究表明，肠道微生物群与癌症恶病质的发生发展密切相关。癌症恶病质作为代谢功能障碍的多因素综合征，肠道微生物群是宿主代谢的重要调节因子^[8]。在癌症恶病质进展过程中，肠道菌群失调可导致肠道屏障功能受损，进而引发癌症恶病质患者全身和肠道炎症的持续存在^[9]。中医强调癌症恶病质病位在脾，而“脾主肌肉”。骨骼肌萎缩是癌症恶病质的主要临床特征，其根源在于脾虚生化乏源，气血津液不得充养全身，因此健脾益气是贯穿癌症恶病质治疗的核心^[10]。现代研究证明，肠道微生物与肌肉功能之间联系密切^[11]，肠道微生物群代谢物用于肌肉葡萄糖和肌糖原代谢，对维持肌肉功能有重要作用^[12]。“肠-肌肉轴”概念与“脾主肌肉”理论显著相关。此外，最新研究表明“脾主运化”的生物学功能与肠道微生物参与机体营养代谢、免疫反应以及能量代谢方面密切相关^[13]，表明“脾-肠道菌群-肌肉”与癌症恶病质疾病发生发展和治疗密切相关。

中医药可以通过与肠道菌群的相互作用起到促进人体健康以及发挥疗效的作用^[14]，以肠道菌群为靶点运用中医药干预疾病是当前的研究热点。二藤散结胶囊是山西省中医院的院内制剂，有益气健脾、解毒散结之效。二藤散结胶囊在临床被应用于消化道肿瘤的辅助治疗，但二藤散结胶囊治疗癌症恶病质的作用及机制仍需基础研究的证实。因此，本课题构建CT26肠癌恶病质小鼠模型，通过观察二藤散结胶囊对肠癌恶病质小鼠脏器质量、腓肠肌质量、体质量、腓肠肌组织病理学改变及肠道微生物的影响，进而探讨二藤散结胶囊治疗肠癌恶病质可能的机制。

1 材料 1.1 实验动物

动物雄性SPF级Balb/C小鼠40只，鼠龄6~8周，体质量22 g左右，由北京华阜康生物有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2024-0003。小鼠饲养于SPF级动物房，生活环境温度适宜，12 h∶12 h昼夜间断照明，自由饮水、摄食。小鼠适应性喂养1周后，进行称质量。本实验经山西省中医药研究院伦理委员会批准（伦理批号：2024KY-07053）。

1.2 药物

二藤散结胶囊为山西省中医院院内制剂（批准文号：晋药制字AZ20090347）属于免煎颗粒，其药味组成为太子参、炒白术、薏苡仁、姜半夏、陈皮、砂仁、壁虎、大血藤、菝葜、野葡萄藤、猕猴桃根、夏枯草、牡蛎、莪术、槟榔、甘草。

1.3 试剂

RPMI1640培养基（Gibco）；无噬菌体低内毒素特级胎牛血清（四季青）；一步冻存液（海星生物）；胰酶溶液（大连美仑生物技术有限公司）；青霉素/链霉素（大连美仑生物技术有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、肌肉型组织固定液、环保型脱蜡液（Servicebio）；无水乙醇、二甲苯、中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。

1.4 仪器

恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；双人单面垂直净化工作台（苏州净化设备有限公司）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；超低温冰箱（Thermo Fisher）；4 ℃冰箱（Haier）；脱水机（DIAPATH）；组织包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（上海徕卡有限公司）；冰冻切片机（赛默飞世尔科技中国有限公司）；光学显微镜（上海富莱光学科技有限公司）。

2 方法 2.1 癌症恶病质模型建立

鼠源结肠癌CT26细胞株购自苏州海星生物有限公司。CT26细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中，并置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养，每2天进行换液。当细胞密度生长至80%时，进行传代。待细胞传代至足够数量，用胰酶消化并计数，用PBS重悬为1×10⁷ /mL的细胞悬液置于冰盒备用。

除正常组外，其余组小鼠参照参考文献^[15]进行造模：每只小鼠右腋皮下注射0.1 mL（1×10⁷ /mL）的细胞悬液，操作于1 h内完成。每日观察小鼠状态，等待成瘤。造模后第7天，荷瘤小鼠右侧腋下均可见、可触及瘤块。随后，荷瘤小鼠逐渐出现活动减少、摄食下降、毛发杂乱无光泽、消瘦等恶病质表现。造模后第11天，模型组去瘤体质量相较正常组体质量降低5%，表明造模成功^[16]。

2.2 实验分组与给药

运用随机数法，将小鼠随机分组：8只小鼠作为正常组，其余小鼠进行造模分为模型组、二藤散结低剂量组、二藤散结中剂量组、二藤散结高剂量组。按照体表面积折算法计算等效剂量，则二藤散结低剂量组给药量为0.75 g/kg，二藤散结中剂量组给药量为1.5 g/kg，二藤散结高剂量组给药量为3 g/kg。各组小鼠均按照0.02 mL /g体积进行灌胃，二藤散结低、中、高剂量组小鼠分别被给予相应浓度的二藤散结胶囊混悬液，而模型组则予以等体积蒸馏水进行灌胃。二藤散结胶囊用蒸馏水混悬，并超声处理30 min，制成二藤散结胶囊混悬液，置于4 ℃冰箱保存，每次灌胃前置于温水中水浴至常温。造模后，待荷瘤小鼠皮下均可明显触及瘤块，则进行给药，各组均每天给药2次，给药14 d后，处死小鼠并取材。

2.3 检测指标 2.3.1 基本指标检测与取材

造模后第7天荷瘤小鼠皮下明显可见肿瘤，每日称量小鼠体质量，并每2日使用游标卡尺测量荷瘤小鼠皮下肿瘤的长径（a）与短径（b），估算肿瘤质量（肿瘤质量=0.52×a×b²），统计实验过程中荷瘤小鼠去瘤体质量的变化并绘制折线图（去瘤体质量=荷瘤小鼠质量-肿瘤质量）。在给药组小鼠接受药物干预14 d后，禁食不禁水饲养12 h，取新鲜的小鼠粪便并迅速冻存于-80 ℃冰箱，用于检测肠道菌群。称质量后，对小鼠进行脱颈椎处死，解剖取得肝脏、脾脏、肿瘤、腓肠肌标本进行称质量，并取各组小鼠部分腓肠肌组织固定于4%多聚甲醛中，用于病理分析，其余腓肠肌冻存用于后续检测。

2.3.2 组织病理学检测

取腓肠肌组织固定于4%的多聚甲醛溶液中，固定24 h以上。将组织取出并修切，将修切好的组织放于包埋盒内。脱水浸蜡，放于包埋机包埋，于-20 ℃冷却，凝固后修整切片。对石蜡切片脱蜡至水，高清恒染预处理1 min，进行苏木精-伊红（HE）染色，脱水封片，显微镜下观察，采集图像。

2.3.3 粪便16S rDNA测定小鼠肠道菌群

末次给药后，对各组小鼠禁食不禁水12 h。以正常组、模型组及二藤散结胶囊低、中、高剂量组小鼠肠内容物为检测样本，每组随机选择6个样本，放于特定常温保存液中，送于广州承葛医药有限公司进行DNA提取、质检，并构建文库、上机测序。

2.3.4 数据分析

采用Image J软件进行图像分析，所有数据采用GraphPad.Prism9.5进行作图。实验数据均为计量资料，采用SPSS 26.0软件进行分析，数据均以均数±标准差（x±s）表示。若数据满足正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析和LSD事后比较；若数据不满足正态分布或方差齐性，则采用非参数kruskal-wallis检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 二藤散结胶囊对肠癌恶病质小鼠一般情况的影响

造模后各组小鼠去瘤体质量的变化见图 1A。造模后第7天，荷瘤小鼠右侧腋下均可触及成型瘤块；此后随着肿瘤进展，荷瘤小鼠普遍出现去瘤体质量下降。造模后第11天，与正常组相比，模型组去瘤体质量降低5%，且明显低于各给药组。自荷瘤小鼠皮下成瘤至给药结束，给药组去瘤体质量明显高于模型组。最终各组去瘤体质量的比较见图 1B。结果显示，模型组的去瘤体质量较正常组下降了16.01%。与正常组体质量比较，模型组去瘤体质量显著降低（P<0.01）；各给药组与模型组比较，显著改善了肠癌恶病质小鼠去瘤体质量的流失（P<0.05）。其中，二藤散结低剂量组的去瘤体质量较正常组下降了6.9%；二藤散结中剂量组的去瘤体质量较正常组下降了5.24%；二藤散结高剂量组的去瘤体质量较正常组下降了9.61%。

造模后，模型组荷瘤小鼠腓肠肌质量低于正常组，见图 1C；而模型组的肝脏与脾脏质量均高于正常组，见于图 1D、图 1E，差异有统计学意义（P<0.05）。予以二藤散结胶囊治疗后，与模型组比较，二藤散结低剂量组与二藤散结中剂量组改善了肠癌恶病质小鼠腓肠肌质量下降的情况（P<0.05）；二藤散结高剂量组降低了肠癌恶病质小鼠的肝质量（P<0.05）。然而给药组改善肠癌恶病质中脾脏肿大的情况并没有统计学差异，但二藤散结高剂量组有减少肠癌恶病质脾脏肿大的趋势。综上，各给药组中，高剂量组改善肠癌恶病质中肝脾肿大的效果较为突出，而中剂量组改善肠癌恶病质中肌肉流失与去瘤体质量下降的效果较为突出。说明二藤散结胶囊能有效改善肠癌恶病质引起的体质量下降和肌肉流失。

3.2 二藤散结胶囊对肠癌恶病质小鼠腓肠肌组织及纤维横截面积的影响

各组荷瘤小鼠腓肠肌横截面代表图见图 2。正常组肌纤维排列规则，紧密成束。正常组与模型组、二藤散结胶囊低剂量组和二藤散结胶囊高剂量组相比，肌纤维横截面积大。而模型组切片显示肌纤维排列松散，肌束间间隙大，肌纤维面积小。给药组肌纤维横截面积普遍优于模型组，其中二藤散结胶囊中剂量组病理切片显示的肌纤维面积较其他给药组更大，且肌束的排列较其他给药组也更为紧密、规律。

模型组小鼠腓肠肌横截面肌纤维的面积显著低于正常组（P<0.01）；而经过二藤散结胶囊治疗后，与模型组比较，二藤散结胶囊低剂量组、二藤散结胶囊中剂量组、二藤散结胶囊高剂量组3组均显著增加了肠癌恶病质小鼠腓肠肌肌纤维面积（P<0.01），见图 3B。随后通过各组小鼠腓肠肌横截面肌纤维面积频数分布图，进一步分析，正常组的肌纤维面积主要集中在2 000~2 400 μm²，占比为72.22%；模型组肌纤维面积主要集中在1 200~1 600 μm²，占比为64.00%；二藤散结胶囊低剂量组肌纤维面积主要集中在1 600~2 000 μm²，占比为65.11%；二藤散结胶囊中剂量组小鼠肌纤维面积主要集中在2 000~2 400 μm²，占比为54.66%；而二藤散结胶囊低剂量组肌纤维面积主要集中在1 600~2 000 μm²，占比67.78%，见图 3A。二藤散结胶囊低、中、高剂量均能不同程度地改善肠癌恶病质所引起的骨骼肌萎缩问题，其中中剂量改善作用最佳。

3.3 二藤散结胶囊对肠癌恶病质小鼠肠道菌群的影响 3.3.1 二藤散结胶囊改善癌症恶病质小鼠肠道菌群物种丰富度和多样性

在α多样性分析中，Observed、Chao1、ACE指数主要描述菌群物种丰富度，Shannon、Simpson指数反映菌群多样性，结果见图 4。各组间Observed、Chao1、ACE指数差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组相比，模型组Observed、Chao1、ACE指数明显下降，说明肠癌恶病质降低小鼠肠道菌群丰富度；而给药组较模型组明显提高了Observed、Chao1、ACE指数。各组间Shannon、Simpson指数比较差异无统计学意义。与正常组相比，模型组Shannon、Simpson指数下降，而给药组Shannon、Simpson指数明显升高。综上，表明二藤散结胶囊可以提高肠癌恶病质小鼠菌群物种丰富度，改善肠癌恶病质小鼠肠道菌群多样性。

在β多样性分析中，PcoA分析可用于比对样本组之间的差异。各组之间菌群结构差异有统计学意义（P<0.01），见图 5。正常组和模型组的样本完全分离，提示造模成功，表明肠癌恶病质使小鼠肠道菌群发生了显著改变。二藤散结胶囊低剂量组与模型组部分重叠，且沿PCoA1轴分离；二藤散结胶囊中剂量组、二藤散结胶囊高剂量组与正常组部分重叠，主要沿PcoA2轴分散，表明二藤散结胶囊促进肠癌恶病质小鼠肠道菌群趋于正常。

3.3.2 二藤散结胶囊调节癌症恶病质小鼠肠道微生物群结构和功能

从门水平看，正常组主要由拟杆菌门（p_Bacteroidetes，66.71%）和厚壁菌门（p_Firmicutes，30.62%）组成。而模型组与正常组比较，拟杆菌门增多至77.46%，厚壁菌门减少至21.02%。给药组通过调节癌症恶病质小鼠肠道菌群趋于正常组，进而改善癌症恶病质症状。其中，二藤散结胶囊低剂量组中拟杆菌门（70.21%）、厚壁菌门（28.22%）；二藤散结胶囊中剂量组中拟杆菌门（63.32%）、厚壁菌门（32.69%）；二藤散结胶囊高剂量组中拟杆菌门（67.80%）、厚壁菌门（30.32%）。见图 6。

在属水平上各组间具有诸多差异菌（P<0.05）。模型组相较于正常组丰富度降低的包括：un_f_Clostridiales_vadinBB60_group、副拟杆菌属（Parabacteroides）、瘤胃球菌属UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）、un_o_Mollicutes_RF39、乳酸杆菌（Lactobacillus）、红螺菌目（un_o_Rhodospirillales）、肠杆菌属（Enterorhabdus）、GCA-900066225、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）。而丰富度升高的菌属为：葡萄球菌属（Staphylococcus）。通过各组间比较，给药组对肠癌恶病质中菌属un_f_Clostridiales_vadinBB60_group、副拟杆菌属、瘤胃球菌科UCG-014、乳酸菌属、un_o_Mollicutes_RF39的改善较为明显。见图 7。

通过对各组菌群进行LEfSe分析，可以观测各组中的特异性肠道微生物种。从属水平观测组内LDA分值前3位菌属，正常组中特异性菌属主要包括g_un_f_Clostridiales_vadinBB60_group、另枝菌属（g_Alistipes）、副拟杆菌属。模型组中特异性菌属主要是埃希氏菌属（g_Escherichia_Shigella）。而二藤散结胶囊低剂量组中特异性菌属为普雷沃氏菌属（g_Prevotellaceae_UCG_001）、瘤胃梭菌属（g_Ruminiclostridium_6）、乳球菌属（g_Lactococcus），二藤散结胶囊中剂量组中特异性菌属为g_un_f_Clostridiales_vadinBB60_group、g_Rikenellaceae_RC9_gut_group、奇异菌属（g_Atopostipes），二藤散结胶囊高剂量组中特异性菌属前3为副拟杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属（g_Peptococcus）。模型组相较于正常组和给药组肠道微生物丰富度降低，给药组的微生物种类与正常组有部分重合，提示肠癌恶病质往往引起肠道菌群的紊乱，而二藤散结胶囊则通过调节肠癌恶病质小鼠的肠道菌群趋于正常来发挥其疗效。见图 8。

3.3.3 KEGG代谢通路预测

通过KEGG代谢通路预测，富集各组间差异显著的代谢通路（P<0.05），进而了解各组间肠道微生物在代谢途径上功能的差异。如图 9展示差异最为显著的前20条代谢通路，根据显著性自上而下排列分别是：苯丙氨酸代谢；氨基苯甲酸降解；氰基氨基酸代谢；无机离子转运与代谢；膦酸盐和次膦酸盐代谢；苯乙烯降解；己内酰胺降解；抗坏血酸和醛糖酸代谢；谷胱甘肽代谢；乙醛酸和二羧酸代谢；半乳糖代谢；细菌毒素；核苷酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解；戊糖和葡萄糖醛酸相互转化；限制性内切酶；鞘脂代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；布替罗星和新霉素生物合成；α-亚麻酸代谢。其中富集丰度最高的为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸作为人体的必需氨基酸，参与营养和能量代谢。有研究通过对癌症恶病质患者的血浆与尿液代谢物进行分析，发现癌症恶病质早期缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解以及甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸的代谢均受到干扰^[17]。通过对癌症恶病质血浆指纹图谱观察，恶病质患者血浆中最显著的代谢改变是氨基酸和衍生物，特别是精氨酸、色氨酸、吲哚乳酸和苏氨酸，以及甘油磷脂和鞘脂的减少^[18]。

4 讨论

癌症恶病质是常见的癌症并发症，目前机制尚未阐明，临床缺乏有效治疗措施。在中医理论中，该病属于“虚劳”范畴，病位主要在脾，“癌毒致虚”是癌症恶病质的根本病机^[19]。现代学者认为脾的主运化和散卫气功能发挥与肠道菌群关系密切^[20]。肠道菌群在人体中代谢膳食纤维、蛋白质、脂质等是脾主运化的体现，同时肠道菌群参与肠道免疫调节，其代谢产物短链脂肪酸具有抗炎作用，与脾散卫气的功能相契合^[21]。脾-肠道菌群-肌肉与癌症恶病质关系密切^[22-23]，为二藤散结胶囊防治肠癌恶病质研究提供了理论依据。二藤散结胶囊作为临床用于消化道肿瘤辅助治疗的中药制剂，有益气健脾、解毒散结的作用。本研究通过建立CT26肠癌恶病质小鼠模型，并对小鼠进行二藤散结胶囊灌胃治疗，发现二藤散结胶囊可以有效缓解肠癌恶病质小鼠腓肠肌流失和体质量减轻。基于16S rDNA技术的进一步研究，发现二藤散结胶囊改善癌症恶病质作用与调节肠道菌群密切相关。

本次实验结果显示，肠癌恶病质小鼠表现为肠道微生物紊乱，肠道多样性、丰富度下降；二藤散结胶囊干预可以显著提高肠道微生物丰度。本次研究发现在门水平，模型组较正常组拟杆菌门水平升高，与先前研究一致^[24]。肠癌恶病质小鼠相较于正常组表现为厚壁菌门/拟杆菌门比值降低，二藤散结胶囊给药组均表现为厚壁菌门/拟杆菌门比值的升高。既往研究表明在肠癌恶病质小鼠模型中厚壁菌门/拟杆菌门比值是升高的^[25]。而本研究的结果与其相反。另有研究发现与本次研究一致，认为这一结果与维持肠道菌群平衡的代偿机制有关，并且认为这一结果可能与肠癌恶病质体质量变化有相关性^[26]。通过分析属水平上的差异菌属，肠癌恶病质引起肠道微生物的紊乱主要表现在un_f_Clostridiales_vadinBB60_group、副拟杆菌属、瘤胃球菌属、un_o_Mollicutes_RF39、乳酸杆菌、红螺菌目、肠杆菌属、GCA-900066225、嗜黏蛋白阿克曼菌丰富度的降低以及葡萄球菌属丰度的增高。而二藤散结胶囊治疗肠癌恶病质，主要通过显著增加un_f_Clostridiales_vadinBB60_group、副拟杆菌属、瘤胃球菌科UCG-014、乳酸杆菌、un_o_Mollicutes_RF39丰度，调节肠道微生物趋于正常。多项研究表明这些菌群具有治疗疾病作用。狄氏副拟杆菌属具有保护胃肠道和肝脏疾病的潜力。目前发现狄氏副拟杆菌属主要通过免疫调节、改善肠道屏障等作用来阻止疾病进展，并且已经证实多种中药通过增加狄氏副拟杆菌的丰度起到对疾病的治疗作用^[27]。此外，狄氏副拟杆菌属（Parabacteroides. Distasonis）可以降低结直肠癌中炎症因子的表达，并起到一定的抗癌作用^[28]。而通过粪菌移植治疗结肠癌小鼠发现瘤胃球菌属UCG-014与促炎因子表达呈负相关，证实了瘤胃球菌科UCG-014治疗结肠癌的潜力^[29]。乳酸杆菌是一种有益菌，表现出一定的抗癌作用^[30]。补充肠道乳酸杆菌通过NOD1/NF-κB通路，促进肿瘤细胞分泌趋化因子CCL5引起树突状细胞的聚集，起到抑制肠癌的作用^[31]。副干酪乳杆菌CMU-Pb-L5^[32]、罗伊氏乳酸菌^[33]等诸多属于乳酸杆菌属的菌种均被证明具有抑制肠癌的作用。此外，有研究表明癌症恶病质小鼠服用罗伊氏杆菌可以缓解肌肉萎缩^[34]。因此，二藤散结胶囊有效改善肠癌恶病质引起的肌肉流失、肌肉萎缩与体质量减轻，可能与提高有益菌副拟杆菌属、瘤胃球菌科UCG-014、乳酸菌属相对丰度有关。

综上所述，二藤散结胶囊通过改善肠道微生物多样性，促进菌群结构正常化，对肠癌恶病质所致的体质量减轻、肌肉萎缩发挥治疗作用。该制剂基于“脾-肠道菌群-肌肉”轴治疗癌症恶病质，为中医药防治癌症恶病质提供新的证据和支持，但其中的具体机制仍值得继续深入研究与探索。