糖尿病是一种慢性代谢紊乱疾病，以持续性高血糖为核心特征，造成全身多个器官与系统受损，并导致一系列并发症发生，糖尿病肾病（DKD）便是其中一种，约有三分之一的糖尿病患者会受到DKD的影响，DKD也是终末期肾病最主要的致病原因，通常以微量白蛋白尿开始，随着病情的持续进展，会发展为大量白蛋白尿，标志着肾脏损伤的加重^[1-2]。DKD的临床诊疗中包括很多方法如血糖精准调控、钠-葡萄糖协同转运蛋白-2抑制剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂等，但仍存在血管性水肿、高钾血症等，总体疗效欠佳^[3]，因此对治疗方案仍需继续探索。豆甾醇是一种不饱和甾醇，是植物甾醇生物合成途径的最终产物，常见于卷心菜、花生、大豆、向日葵，具有免疫调节、神经保护、抗骨关节炎、糖尿病、抗氧化等特性，且细胞毒性较低，应用前景较为广泛^[4]。豆甾醇是中药复方制剂七二汤参颗粒主要活性成分之一，实验证明七二汤参颗粒可以改善DKD中的尿微量白蛋白尿和肾脏病变，同时还能通过保护肾脏滤过屏障关键结构的足细胞损伤^[5]，但豆甾醇能否不依赖复方中其他成分的协同作用在DKD病理进程中独立发挥作用，目前尚无报道。足细胞是肾脏滤过屏障核心，其损伤会加剧DKD进展；因足细胞增殖能力弱，需依赖线粒体自噬清除受损线粒体以维持功能，而该自噬障碍是推动DKD发展的关键。沉默信息调节因子1（Sirt1）可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）发挥调控作用，PGC-1α作为线粒体生物发生的核心调控因子，能够促进足细胞内正常线粒体生成，间接为足细胞功能维持提供支持，进而在减轻DKD病理进展中发挥作用^[6-7]。本研究通过建立DKD大鼠模型，旨在探讨豆甾醇对DKD大鼠足细胞自噬的影响及潜在作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

本研究中所使用的80只SD大鼠，雌雄各半，7周龄，体质量200~250 g，动物来自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2022-0004，大鼠在特殊的无病原体（温度22~26 ℃、相对湿度50%~60%）条件下饲养，光暗循环12 h，适应性饲喂1周，该研究已获得医学伦理委员会的批准（YX-2025-059-03）。

1.1.2 实验试剂与仪器

北京康瑞纳生物科技有限公司提供豆甾醇（批号83-48-7）；北京天根生化科技公司提供总RNA提取试剂（批号DP424）；上海淳麦生物科技有限公司提供尿素氮（BUN，批号C013-1）；上海江莱生物科技有限公司提供血肌酐（Scr）测定试剂盒（批号JL-T0927）；北京索莱宝公司提供ECL发光液（批号PE0010）；Abcam公司提供足细胞裂孔隔膜蛋白分子（Nephrin批号ab216341、Podocin批号ab181143）及沉默信息调节因子1（Sirt1，ab189494）；Cell Signaling提供过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）抗体（批号2178）。长沙三诺有限公司提供GLM-78血糖仪；杭州奥盛公司提供AMR-100酶标仪；日本HITACHI公司提供HT7800/HT7700透射电子显微镜；徕卡公司提供RM2235石蜡切片机。

1.2 方法 1.2.1 DKD大鼠模型的制备及干预

根据随机数字表法，选取10只大鼠作为正常组，其余70只为造模组，其中造模组给予大鼠高糖和高脂肪饮食（63.9%普通饲料、5%蛋黄粉、1%胆固醇、20%蔗糖、10%猪油、0.1%胆汁钠）喂养8周；正常组大鼠以普通饲料喂养8周。随后对大鼠禁食不禁水12 h，然后腹腔注射35 mg/kg新鲜制备的1%链脲佐菌素溶液，正常组大鼠注射等体积的柠檬酸盐缓冲液；72 h后，从尾后静脉随机测量大鼠血糖，连续5 d的随机血糖值不低于16.7 mmol/L，且24 h尿液中尿蛋白含量检测超过30 mg，表明DKD模型成功^[8-9]。将造模成功的50只大鼠随机分为DKD组、不同剂量的豆甾醇（豆甾醇-低、豆甾醇-高）组、缬沙坦组、豆甾醇-高+EX527组，根据预实验及参考文献^[10]，豆甾醇-低、豆甾醇-高组DKD大鼠每天以灌胃方式干预，剂量为50 mg/kg或200 mg/kg，持续4周；缬沙坦组DKD大鼠每天以灌胃方式干预，剂量为8.33 mg/kg^[11]，持续4周；豆甾醇-高+EX527组每天以灌胃200 mg/kg豆甾醇，并腹腔注射5 mg/kg EX527^[12]，持续4周；DKD组及正常组大鼠每天均以生理盐水干预，持续4周。治疗结束后，所有大鼠均在深度麻醉下通过颈部脱位安乐死，并分别采集肾组织和血样进行生化和病理评估。

1.2.2 尿蛋白含量及血糖评估

从尾静脉采集血液，血糖仪检测血糖值；采集24 h全尿，尿蛋白定量测试盒检测尿蛋白含量。

1.2.3 肾功能指标检测

在血糖检测的同时，经眼眶静脉取血，以3 500 r/min离心10 min，离心半径10 cm，离心后采集血清，试剂盒检测Scr、BUN水平。

1.2.4 肾组织病理学评估及足细胞结构、自噬小体变化

处死所有大鼠，解剖左肾上半部皮质组织，用4%多聚甲醛固定，用无水乙醇分别以70%、80%、90%和95%梯度洗脱30 min，随后包埋在石蜡中，切成4 μm厚切片，苏木精-伊红（HE）染色后，观察肾组织病理变化，并在光学显微镜下拍照。取约1 mm3左肾下半部皮质组织，在4 ℃下快速放入2.5%戊二醛、1%铵酸固定液中，用乙醇-丙酮脱水后，渗透剂渗透，将其浸润、包埋和切割以制备50 nm的超薄切片，铀和铅双重染色后，观察肾足细胞的病理损伤及自噬体变化，并用透射电镜拍摄。

1.2.5 肾组织Nephrin和Podocin阳性表达变化

右肾上半部皮质样品固定并包埋在石蜡中，在二甲苯中脱蜡，在分级乙醇及水中水合，经抗原修复和山羊血清封闭后，然后与抗Nephrin、Podocin抗体（稀释比例均为1∶1 000）在4 ℃下孵育过夜，然后用二抗孵育30 min，二氨基联苯胺染色，苏木精复染，脱水、纯化、固定，分析5个视野中Nephrin、Podocin阳性染色比。

1.2.6 肾组织中自噬标志蛋白（Beclin-1、P62）mRNA表达

收集右肾下半部皮质样品，提取组织总RNA，并测定浓度，分别以总RNA为模板，使用反转录试剂盒进行反转录。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒在Applied Biosystems 7900实时荧光定量PCR系统上进行定量PCR分析，随后进行qPCR扩增，预变性95 ℃ 10 min，95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸40 s循环40次，引物由上海生工生物合成，基于2^-ΔΔCt法计算mRNA水平的相对定量。β-actin上游引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；下游引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′；Beclin-1上游引物：5′-CAAGATCCTGGACCGTGTCA-3′；下游引物：5′-GTGACGTTGAGCTGAGTGT-3′；P62上游引物：5′-TTCAGCTTCTGCTTCAGCCC-3′；下游引物：5′-CTCCTGAGCACATGGTGGG-3′。

1.2.7 肾组织Sirt1和PGC-1α蛋白表达

收集每组大鼠右肾下半部皮质样品，快速均质后，向组织样品中加入蛋白裂解缓冲液，冰上裂解组织并12 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，取上清液，定量并调节蛋白质浓度，分离蛋白质并转移到PVDF膜上，在4 ℃下孵育Sirt1、PGC-1α抗体（稀释比例1∶1 000）过夜，室温下加入二抗（稀释比例1∶2 000）孵育2 h，洗膜后，用ECL化学发光并分析暗室曝光后的结果，Image J软件定量蛋白表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 27.0软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。单因素方差分析用于多组间比较，以snk-q检验进一步两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 豆甾醇对各组大鼠血糖和尿蛋白的影响

血糖、尿蛋白比较：DKD组高于正常组（P < 0.05）；豆甾醇-低组、豆甾醇-高组、缬沙坦组低于DKD组（P < 0.05）；豆甾醇-高+EX527组高于豆甾醇-高组（P < 0.05）。见表 1。

2.2 豆甾醇对各组大鼠Scr和BUN水平的影响

Scr、BUN比较：DKD组高于正常组（P < 0.05）；豆甾醇-低组、豆甾醇-高组、缬沙坦组低于DKD组（P < 0.05）；豆甾醇-高+EX527组高于豆甾醇-高组（P < 0.05）。见表 2。

2.3 豆甾醇对各组大鼠肾组织病理学评估及足细胞结构、自噬小体的影响

HE结果显示，正常组大鼠肾组织结构正常，肾小球均匀分布；DKD组肾小球肥大，并出现血管瘀血、扩张；豆甾醇及缬沙坦干预后，肾组织病变减轻；豆甾醇-高+EX527组的组织病变接近豆甾醇-低组。见图 1。

透射电镜结果显示，正常组大鼠足细胞结构、线粒体结构及基底膜正常，自噬小体存在于细胞内，未见足细胞足突融合；DKD组基底膜增厚，足细胞缩短，自噬小体减少，足细胞足突融合；豆甾醇及缬沙坦干预后，足细胞结构及足细胞足突融合有所改善，自噬小体增加；豆甾醇-高+EX527组足细胞超微结构接近豆甾醇-低组。见图 1。

2.4 豆甾醇对肾组织Nephrin和Podocin阳性表达的影响

Nephrin、Podocin阳性表达比较：DKD组低于正常组（P < 0.05）；豆甾醇-低组、豆甾醇-高组、缬沙坦组高于DKD组（P < 0.05）；豆甾醇-高+EX527组低于豆甾醇-高组（P < 0.05）。见图 2、表 3。

2.5 豆甾醇对肾组织Beclin-1和P62 mRNA表达的影响

Beclin-1 mRNA比较：DKD组低于正常组（P < 0.05）；豆甾醇-低组、豆甾醇-高组、缬沙坦组高于DKD组（P < 0.05）；豆甾醇-高+EX527组低于豆甾醇-高组（P < 0.05），各组P62 mRNA表达趋势与Beclin-1 mRNA表达相反（P < 0.05）。见表 4。

2.6 豆甾醇对肾组织Sirt1和PGC-1α蛋白表达的影响

Sirt1、PGC-1α蛋白表达比较：DKD组低于正常组（P < 0.05）；豆甾醇-低组、豆甾醇-高组、缬沙坦组高于DKD组（P < 0.05）；豆甾醇-高+EX527组低于豆甾醇-高组（P < 0.05）。见图 3、表 5。

3 讨论

DKD是全世界糖尿病最常见的并发症之一，目前DKD的治疗仅限于延缓疾病的发生和进展，不能有效逆转肾损伤和功能障碍或预防终末期肾病的发展^[13]，因此继续研究其有效治疗方案具有重要意义。

足细胞是终末分化的肾小球内脏上皮细胞，位于肾小球基底膜泌尿侧，其核心作用是维持肾小球滤过屏障的完整性与肾小球正常结构；而肾小球滤过屏障功能及肾小球结构的稳定，与DKD的发病密切相关，因此足细胞在DKD的发病机制中扮演着关键角色^[14-15]。足细胞通常表现出高水平的自噬，自噬对于保持细胞稳态至关重要，有助于足细胞抵抗细胞损伤，以维持其结构和功能完整性，因此寻找可以促进或维持足细胞自噬可能有助于DKD治疗^[16]。本研究通过建立DKD大鼠模型，以血糖及尿蛋白评估DKD造模成功，结果发现DKD大鼠中肾功能指标Scr、BUN明显升高，自噬小体减少，自噬标志蛋白Beclin-1 mRNA减少，P62 mRNA表达增加，足细胞裂孔隔膜蛋白分子（Nephrin、Podocin）表达降低，提示足细胞自噬参与DKD的发生，引发足细胞损伤。豆甾醇作为植物甾醇，因其多样化的生物活性应用于癌症、神经系统疾病、糖尿病等多种疾病的治疗，有助于改善人类健康^[17]。另外，豆甾醇作为多种中药的主要成分，可有效参与治疗DKD，如雷公藤、当归等^[18-19]，但其单独治疗效果尚未报道。DKD大鼠经豆甾醇干预后，足细胞自噬水平显著提升，同时足细胞关键功能蛋白Nephrin、Podocin的表达上调，进而减轻了足细胞损伤及DKD相关病理改变，最终实现肾功能改善，这提示豆甾醇有望单独作为DKD的治疗药物。

Sirt1/PGC-1α通路作为调控线粒体功能的经典信号通路，在DKD的病理进程中发挥着关键的保护作用，其中Sirt1是一种依赖NAD（+）的去乙酰化酶，不仅在细胞衰老调控中具有重要意义，已得到证实其对DKD状态下足细胞损伤发挥保护作用^[20]。同时PGC-1α是线粒体生物发生和功能的关键调节因子，Sirt1/PGC-1α通路激活能提升足细胞线粒体自噬水平，及时清除受损线粒体，帮助足细胞抵御DKD损伤，延缓其进展^[21]。本研究结果显示DKD大鼠肾组织中Sirt1、PGC-1α蛋白表达降低，自噬水平降低，DKD大鼠损伤严重，提示Sirt1/PGC-1α通路介导的足细胞线粒体自噬影响DKD发展。但经豆甾醇干预后，上调了Sirt1、PGC-1α蛋白表达，促进足细胞线粒体自噬，减少足细胞损伤，推断豆甾醇促进足细胞自噬延缓DKD发展，其机制与激活Sirt1/PGC-1α通路有关。实验表明，Sirt1/PGC-1α通路抑制剂-EX527引入，逆转了豆甾醇对DKD大鼠的保护作用，表明豆甾醇可促进DKD大鼠足细胞自噬，保护足细胞，减轻DKD病理损伤。

综上所述，豆甾醇可促进DKD大鼠足细胞自噬，减轻足细胞损伤，改善肾功能，其机制可能与激活Sirt1/PGC-1α通路有关，但存在机制阐释不深入（如Sirt1/PGC-1α通路的上游靶点及下游分子机制）、缺乏体外验证豆甾醇的直接保护作用等不足。未来需进一步探究通路调控细节、结合体外实验验证，优化给药剂量并评估长期效果，为其临床转化提供更充分依据。