脓毒症本质上属正气不足、瘀血阻滞、热毒壅盛，且多与机体正气虚弱，同时外感六淫邪气或虫兽毒物等致病因素，导致气机逆乱相关^[1]。研究显示，脓毒症是由细菌、病毒、真菌等病原体侵入人体组织引起的严重传染病，严重者可导致全身炎症反应综合征、多器官衰竭和死亡^[2-3]。而脓毒症心肌病（SICM）患者病死率为30%~70%，是非心源性败血症患者的2~3倍^[4-5]。因此，积极治疗SICM是降低脓毒症病死率的有效手段。目前SICM的传统西医治疗疗效欠佳。而在多个中国脓毒症诊治共识中均指出中医药治疗脓毒症及SICM的有效性和安全性^{[1, 6]}。其中，《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南》推荐血必净注射液（XBJ）应用于脓毒症患者及包括SICM在内并发症的治疗^[6]。

XBJ主要由红花、赤芍、川芎、丹参、当归组成，是中国王今达教授团队根据“菌毒炎并治”理论，以多种中医经典复方提取^[7]。目前该药由中国食品药品监督管理局于2004年批准（批准号：Z20040033）。现代药理学研究表明XBJ可防止炎症因子过度释放、拮抗细菌内毒素、增强组织微循环、保护血管内皮细胞、改善免疫功能紊乱等^[8]。翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）是存在于多物种的高度保守的蛋白质。目前发现TCTP在心肌细胞增殖与存活中起关键作用，并可作为预防心肌细胞死亡的靶点之一^[9]。蛋白激酶B（AKT）/肿瘤蛋白53（P53）信号通路在心肌损伤中发挥重要作用，例如通过增强AKT/P53介导的抗凋亡作用可改善糖尿病心肌病的心功能抑制和肥厚重构^[10]。目前尚未见XBJ通过TCTP/AKT/P53通路改善脓毒症大鼠心肌损伤的相关研究。本研究通过构建脓毒症大鼠模型，基于TCTP/AKT/P53信号通路揭示中药制剂XBJ对SICM大鼠的保护作用，为XBJ治疗SICM提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 动物实验与药物治疗

在宁夏医科大学实验动物中心购买18只成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠完成适应性饲养后随机分为3组：1）假手术组（Sham）；2）盲肠结扎穿孔术组（CLP）；3）血必净治疗组（XBJ），每组6只。采用CLP术构建SICM模型。XBJ（批准号：Z20040033）于宁夏医科大学总医院药剂科购买，CLP手术后1 h在麻醉清醒后开始接受XBJ（10 mL/kg）腹腔注射治疗，持续3 d，Sham组和CLP组大鼠给予等量生理盐水；该实验设计与课题组前期研究方法^[11]。本研究动物实验获得了宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（KYLL-2023-0495）。

1.2 病理染色

大鼠心脏组织经固定、包埋及切片处理后，使用苏木精-伊红（HE）染色法，按碧云天生物技术有限公司（货号：C0105S）说明书进行染色。光学显微镜下观察心脏组织的形态学变化。

1.3 大鼠心脏彩超

使用Vevo^® 2100超高分辨率小动物超声成像系统（Visualsonics，Toronto，Canada）配备15 MHz换能器对大鼠心功能进行评估。在4%戊巴比妥（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉下，采用胸骨旁长轴位进行二维成像，并在垂直于室间隔和左室后壁的方向进行M模式成像。检测大鼠的左室射血分数（LVEF）和左室缩短分数（LVFS）。

1.4 生化检测

使用全自动生化分析仪（Bio Majesty JCA-BM6010，JEOL Ltd，Japan）测定大鼠血清中肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）的浓度。

1.5 炎症因子测定

使用ELISA试剂盒检测血清中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达水平，所有试剂盒均购买自武汉贝茵莱生物公司。

1.6 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测

各组大鼠心脏组织中提取蛋白质样本，按照Western blot标准操作流程，检测TCTP、p-AKT、AKT、P53、Bax、Bcl-2、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的蛋白表达水平。p-AKT、AKT、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase 3、Caspase 3、GAPDH及ECL发光液均购自Affinity公司；TCTP和P53则购自武汉三鹰生物科技有限公司。

1.7 免疫荧光检测

使用免疫荧光技术检测心肌组织中TCTP、p-AKT和P53的表达水平。首先，用0.5% Triton X-100溶液处理固定的心脏组织，去除细胞膜并孵育20 min。接着，用5% 牛血清白蛋白（BSA）阻断液在室温下阻断60 min，随后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗。将心脏组织分别与TCTP（1∶200）、p-AKT（1∶100）和P53（1∶100）抗体孵育过夜（4 ℃）。接下来，使用山羊抗兔IgG H&L（AlexaFluor^®594）二抗（1∶100）进行标记，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）对心脏组织进行核染色。最后，利用荧光显微镜观察。

1.8 免疫组织化学检测

采用免疫组织化学技术检测大鼠心脏组织中Bcl-2、Bax和Caspase 3的表达水平。首先，切片标本经过常规脱蜡和水化处理后，使用相应的一抗（Bcl-2、Bax、Caspase 3抗体）进行孵育。使用二抗结合辣根过氧化物酶（HRP）进行标记，通过3，3’-二氨基联苯（DAB）显色法显现抗原表达。使用光学显微镜观察，评估Bcl-2、Bax和Caspase 3的表达分布和强度。

1.9 统计学分析

所有数据分析均通过GraphPad Prism 9软件进行。数据以至少3次独立实验的均数±标准差（x±s）表示。数据采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐性检验使用最小显著差异（LSD）方法，若方差不齐则采用Tamhane’s T2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 XBJ对SICM大鼠模型的心肌病理改变的影响

与Sham组相比，CLP组大鼠心肌细胞肿胀，排列紊乱，组织松散，间质水肿，炎性细胞浸润。而与CLP组相比，经过XBJ处理后，心肌组织细胞肿胀明显改善，间质水肿减轻，且排列较为整齐（图 1）。

2.2 XBJ对SICM大鼠模型心功能的影响

与Sham组相比，CLP组的LVFS和LVEF显著降低，且LDH及CK表达水平均显著升高（P＜0.05）。在XBJ连续治疗后，与CLP组相比，LVFS和LVEF明显恢复，而LDH和CK的表达水平均显著降低（P＜0.05）。见图 2。

2.3 XBJ对SICM大鼠模型炎症因子的影响

CLP组大鼠的TNF-α、IL-6以及IL-1β血清水平显著高于Sham组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。XBJ治疗后显著降低了CLP组大鼠的TNF-α、IL-6和IL-1β水平（P＜0.05）。见表 1。

2.4 XBJ对SICM大鼠模型心肌细胞凋亡的影响

CLP组中Bax及Cleaved Caspase3表达显著上调，而Bcl-2表达显著下调（P＜0.05）。给予XBJ治疗后显著逆转了这些凋亡相关蛋白的表达变化（P＜0.05）。见图 3。

2.5 XBJ对SICM大鼠模型心肌细胞中TCTP/AKT/P53信号通路的影响

与Sham组相比，CLP组大鼠心脏组织中TCTP、p-AKT蛋白水平显著上升，P53的表达水平明显下调而（P＜0.05），而XBJ治疗显著逆转了上述蛋白的表达水平（P＜0.05）。免疫荧光检测结果与Western blot结果趋势一致。见图 4。

3 讨论

脓毒症在中医中被视为外邪侵袭引发的全身性疾病，常由湿热、风寒等邪气入侵引起，导致气血虚弱、脏腑功能失调。脓毒症初期表现为高热、寒战、脉搏快，属于“热毒炽盛”；气血不足、脏腑受损是后期症状，表现为乏力、面色苍白、脏腑肿胀等^[12]。而SICM是由气虚、血瘀引起的心脏功能受损，气虚导致心脏泵血不足，血瘀则加重心脏负担。中医治疗SICM主要强调清热解毒、通里攻下、活血化瘀、扶正固本，进而恢复机体的自我调节能力，减轻心肌负担，促进康复^[12]。例如，中药制剂XBJ联合常规治疗后5 d或7 d可有效改善心脏肌钙蛋白（cTnI）、肌酸激酶-MB（CK-MB）、N端前B型利钠肽（NT-proBNP）、降钙素原（PCT）水平以及减少住院时间，侧面说明XBJ可有效辅助SICM的治疗^[13]。但中药治疗SICM的分子机制仍未明。因此深入挖掘中医药治疗SICM的分子机制显得尤为重要。目前已知，细胞凋亡、自噬、细胞焦亡在内的程序性细胞死亡以及炎症反应、氧化应激等均与SICM的发生相关^[14-15]。进一步药理学研究发现，XBJ具有防止炎症因子过度释放、拮抗细菌内毒素、增强组织微循环、保护血管内皮细胞、改善免疫功能紊乱等的作用^[8]。为进一步明确XBJ治疗SICM分子机制，笔者设计了本实验。本研究发现XBJ可以缓解脓毒症大鼠模型的心肌损伤。HE染色观察到CLP处理后大鼠心肌细胞肿胀畸形，排列紊乱；心脏超声显示LVEF和LVFS值显著下降；加之，CLP组的大鼠心肌损伤标志物CK和LDH的血清水平显著上调，XBJ可以逆转CLP组上述心肌损伤。

在SICM发生过程中，全身性炎症反应可引发微血管内皮损伤，导致持续性低血压和器官衰竭，严重时可能危及生命^[16]。类似的，在本研究中采用ELISA法检测出CLP组炎症标志物IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高。Sun等^[17]研究认为，抗炎和抗氧化应激对脓毒症患者心脏具有保护作用。因此，XBJ能够有效抑制炎症反应，预防脓毒症患者的微循环障碍及血管内皮细胞损伤，极大地改善患者预后^[18]。与上述结果相类似，笔者观察到CLP组大鼠经XBJ治疗3 d后可以显著下调炎症因子的水平，这表明XBJ注射液能够缓解脓毒症所引起的全身性炎症反应。

相关研究表明，细胞凋亡、自噬、细胞焦亡在内的程序性细胞死亡以及炎症反应、氧化应激等均与SICM的发生相关^[19]。其中，炎症反应失调诱发心肌细胞凋亡在SICM的机制研究中已得到充分验证^[20]。Wei等^[20]发现，在SICM的发生发展中，炎症反应增加了ROS在内的体内自由基的生成，进而攻击细胞膜、蛋白质和DNA，导致细胞内氧化损伤。这种氧化损伤能够激活细胞的凋亡途径，损害细胞的功能。细胞凋亡可直接导致心肌细胞的丧失，降低心脏泵血功能。随着心肌细胞死亡的增加，心脏功能逐渐衰竭，脓毒症患者心肌损伤逐步加重。此外，CLP诱导了大鼠心脏组织中Bax的过表达以及Bcl-2低表达^[21]。因此，抑制心肌细胞凋亡能够有效保护脓毒症患者的心脏功能^[22]。孟繁甦等^[23]发现，XBJ可通过抑制够降低心肌细胞氧化损伤、减少心肌细胞凋亡，发挥SICM大鼠模型的心肌保护作用。与上述研究类似，笔者通过Western blot及免疫组化检测到CLP诱导的脓毒症模型促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase3的表达显著上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则下降。经过XBJ治疗后，上述凋亡相关蛋白的表达水平反转，表明XBJ能够通过抑制细胞凋亡，缓解SICM。

已知AKT/P53、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶（ERK）等多个信号通路通过影响细胞凋亡而参与心血管疾病的发生发展^{[10, 24]}。AKT/P53信号通路是指激活后的AKT通过促进P53核输出和作为E3泛素连接酶靶向P53进行26S蛋白酶体降解等途径来抑制P53的活性，进而发挥对细胞凋亡在内的表型控制，在心血管疾病中发挥重要作用^[25]。例如，增强AKT/P53信号通路可阻断异丙肾上腺素（ISO）诱导的H9C2细胞凋亡信号，进而治疗应激性心肌细胞损伤^[26]。目前已发现TCTP在SICM大鼠模型中表达水平发生改变，并且经过血必净治疗后，SICM大鼠模型肝脏中TCTP表达水平明显降低^[27]。此外，TCTP可通过调控AKT的信号通路，抑制P53的表达，使细胞保持较高的代谢水平，保护细胞免受外界应激诱导的凋亡^[28]。因此，TCTP/AKT/P53信号通路轴在调控心肌细胞增殖过程中扮演重要角色。本研究在SICM大鼠模型中检测到CLP处理可造成心肌组织TCTP表达降低，进而促进AKT的活化，增强了其对P53的抑制作用，而XBJ处理后可以上调TCTP的表达，增强其对AKT活化的抑制，增强P53的表达。

综上所述，笔者通过CLP术成功构建了SICM大鼠模型，并观察到XBJ治疗后能够显著缓解心肌损伤。其可能机制涉及通过调控TCTP/AKT/P53信号通路，抑制炎症反应和细胞凋亡。然而，由于XBJ作为中药制剂具有多成分的特性，其作用机制复杂且途径多样。未来的研究应结合体内动物模型和体外细胞模型，进一步探讨血必净的具体作用机制。此外，可采用慢病毒、质粒转染及基因修饰技术，构建TCTP特异性表达模型，以深入解析血必净通过TCTP/AKT/P53信号通路改善SICM的分子机制。