阿霉素（DOX）是一种蒽环类抗肿瘤药物，是用于治疗卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌等多种类型肿瘤的最有效药物之一。但DOX引起的不良反应如心律不齐、中性粒细胞减少、心脏毒性、脑神经元损伤等，阻碍了其临床应用^[1]。DOX可引起心肌不可逆损伤，长期用药可使患者出现心力衰竭、扩张型心肌病等，严重影响治疗效果^[2]。DOX引起心脏毒性与细胞凋亡、自噬、氧化应激、线粒体损害等机制有关^[3]。五参汤由沙参、苦参、玄参、丹参等组成，对心肌梗死、病毒性心肌炎、心绞痛等心血管疾病具有较好的治疗效果^[4]。王继儒等^[5]研究显示，五参汤可能通过抑制Caspase-3的蛋白表达，同时增加Bcl-2的蛋白表达，通过调节凋亡相关信号通路，缓解慢性心力衰竭小鼠的心功能障碍。但是，五参汤对DOX诱导的心脏毒性的影响尚不清楚。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路是机体内重要的抗氧化信号通路，与脑梗死、关节炎、糖尿病、癌症等疾病机制密切相关^[6-7]。增强Nrf2/ARE信号通路，抑制氧化应激与细胞凋亡，减轻慢性低氧环境大鼠心肌损伤^[8]。五参汤能否通过Keap1-Nrf2/ARE信号通路减轻DOX所致大鼠心脏损伤尚不清楚，本研究基于Keap1-Nrf2/ARE信号通路，探讨五参汤对DOX诱导大鼠心肌损伤的影响及其可能的作用机制，为疾病治疗提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 实验动物

将购自于湖北贝恩特生物科技有限公司[生产许可：SCXK（鄂）2021-0027]的SPF级SD雄性大鼠^[9]饲养于室内温为20~25℃，湿度为50%左右，明暗交替12 h/12 h的环境中，自主饮食摄水。本研究经湖北贝恩特生物科技有限公司动物伦理委员会批准（批号：BNT-2024-0537）。

1.2 主要试剂及仪器

五参汤组成：太子参、大青叶各20 g，玄参、丹参、沙参、苦参、炙甘草、桂枝各10 g，黄芪30 g，五味子6 g，均购自北京同仁堂。将各药材混合，加10倍水煎煮2次，合并药液后浓缩至6 g/mL，4 ℃保存。

辅酶Q10胶囊（规格：10 mg，批准文号：国药准字H19999170），上海衡山药业有限公司；阿霉素（货号：30183118），上海甄准生物科技有限公司；Nrf2抑制剂ML-385（M304758），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB，CSB-E14403r）、乳酸脱氢酶（LDH，CSB-E11324r）、cTnI心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI，CSB-E08594r）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，CSB-E12146r）试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD，YQ-3828）、活性氧（ROS，YQ-4020），上海研启生物科技有限公司；HE染色试剂盒（BP-DL017），南京森贝伽生物科技有限公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光，HY-K1079），MCE公司；Keap1（K001511P）、Nrf2（K002410P）、血红素加氧酶-1（HO-1，K002757P）抗体，北京Solarbio公司。

Spectra Max i3x酶标仪美谷分子仪器，（上海）有限公司；D550VET超声成像仪，江苏飞依诺科技股份有限公司；E100光学显微镜，日本尼康公司；Hitachi H7650型透射电镜，日本日立公司。

1.3 方法 1.3.1 建模及分组

根据参考文献[10]建立DOX大鼠模型，大鼠给予腹腔注射2.5 mg/kg DOX，1次/3 d，共6次，使总剂量达到15 mg/kg，对照组（Control组）给予等量生理盐水。

造模成功后，将大鼠分为Control组、DOX组、辅酶Q10组（Q10组）、五参汤低剂量组（WSD-L组）、五参汤高剂量组（WSD-H组）、五参汤高剂量+Nrf2抑制剂组（WSD-H+ML-385组），每组12只。根据文献[10]，Q10组给予大鼠灌胃30 mg/kg辅酶Q10，根据人（70 kg）与大鼠剂量换算关系，WSD-L组、WSD-H组分别给予大鼠大鼠灌胃12.2、24.4 g/kg五参汤，WSD-H+ML-385组，给予大鼠灌胃24.4 g/kg五参汤与腹腔注射30 mg/kg的Nrf2抑制剂^[11]，Control组、DOX组以相同方式给予等量生理盐水，每日1次，给药14 d。

1.3.2 超声心动图检测

末次给药次日，麻醉大鼠，对各组大鼠进行超声心动图检测，并分别记录左心室收缩末期内径（LVIDs）、左室缩短率（FS），左心室舒张末期内径（LVIDd），计算左室射血分数（LVEF）测量3个不同心动周期，取均值。

1.3.3 血清CK-MB、LDH、cTnI水平检测

超声检测后，腹主动脉采血，离心（3 000 rpm，10 min，离心半径10 cm）后收集血清，-80 ℃保存。采用试剂盒检测血清CK-MB、LDH、cTnI水平。

1.3.4 心肌组织SOD、GSH-Px、ROS水平检测

采血后，每组随机取6只大鼠心肌组织，取部分组织加入生理盐水制成匀浆，离心后，采用试剂盒检测SOD、GSH-Px、ROS水平。剩余组织用4%多聚甲醛固定。

1.3.5 心肌组织病理变化

取固定后的心肌组织行梯度乙醇脱水，石蜡包埋切成薄厚约5 μm切片，HE染色，显微镜下观察心肌组织病理变化。

1.3.6 心肌细胞超微结构

取剩余6只大鼠心肌组织，部分组织于电镜固定液中4 ℃固定过夜，其余组织-20 ℃保存。次日磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗3次，1%的锇酸固定液固定2 h，PBS漂洗3次，再用梯度浓度的乙醇溶液脱水处理，环氧树脂包埋切成70 nm超薄切片，经枸橼酸铅-醋酸铀双重染色，透射电子显微镜下观察。

1.3.7 心肌组织细胞凋亡检测

取1.3.5中石蜡切片，常规方法将切片脱蜡水化，PBS漂洗3次，滴加100 μL蛋白酶K工作液，37 ℃孵育20 min，再加入50 μL TUNEL标记工作液，37 ℃避光反应60 min，PBS漂洗3次，滴加DAPI工作液，室温避光孵育5 min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。

1.3.8 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测心肌组织Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达

取50 mg的1.3.6中冻存的心肌组织置入匀浆器，加入0.5 mL裂解液，匀浆后转至离心管，离心后取上清，蛋白定量后，加入Loading Buffer，100℃水浴变性10 min，分别配置10%分离胶与5%浓缩胶，每孔上样20 μg，电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，与Keap1、Nrf2、HO-1一抗4℃下孵育过夜，TBST洗膜后再与羊抗兔二抗室温孵育60 min，ECL试剂盒显色后，用Geo-Pro软件分析蛋白表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS25或GraphPad 9.0对数据进行统计分析，各组数据均进行正态分布检验，采用均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布且方差齐的实验数据采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 各组大鼠心功能指标

与Control组比较，DOX组LVIDs、LVIDd升高，LVEF、FS降低（P＜0.05）。与DOX组相比，Q10组、WSD-L组、WSD-H组LVIDs、LVIDd降低，LVEF、FS升高（P＜0.05）。与WSD-H组相比，WSD-H+ML-385组LVIDs、LVIDd升高，LVEF、FS降低（P＜0.05）。见表 1、图 1。

2.2 各组大鼠血清CK-MB、LDH、cTnI水平

DOX组血清cTnI、CK-MB、LDH水平较Control组升高（P＜0.05）。Q10组、WSD-L组、WSD-H组血清cTnI、CK-MB、LDH水平较DOX组降低（P＜0.05）。WSD-H+ML-385组血清cTnI、CK-MB、LDH水平较WSD-H组升高（P＜0.05）。见表 2。

2.3 各组大鼠心肌组织氧化应激水平

与Control组比较，DOX组心肌组织ROS水平升高，SOD、GSH-Px水平降低（P＜0.05）。与DOX组相比，Q10组、WSD-L组、WSD-H组ROS水平降低，SOD、GSH-Px水平升高（P＜0.05）。与WSD-H组相比，WSD-H+ML-385组ROS水平升高，SOD、GSH-Px水平降低（P＜0.05）。见表 3。

2.4 各组大鼠心肌组织病理学观察

HE染色结果显示，Control组心肌组织结构正常，细胞排列整齐，未见明显病变；DOX组出现明显心肌细胞坏死，心肌纤维呈现破碎，细胞核固缩或破裂，炎性细胞浸润；Q10组、WSD-L组、WSD-H组心肌病理损伤减轻，细胞排列较为整齐，细胞间质间隙均匀，炎性细胞浸润减少；WSD-H+ML-385组较WSD-H组心肌损伤加重。见图 2。

2.5 各组大鼠心肌组织超微结构

Control组心肌细胞中线粒体形态饱满，线粒体嵴结构清晰，核膜完整，无细胞核固缩或溶解；DOX组心肌组织线粒体数量减少，线粒体肿胀，嵴减少或消失，细胞核核膜皱缩，膜内出现基质溶解；Q10组、WSD-L组、WSD-H组线粒体损伤减少，线粒体肿胀减轻，嵴排列相对整齐，基质均匀；WSD-H+ML-385组较WSD-H组心肌线粒体损伤加重。见图 3。

2.6 各组大鼠心肌组织细胞凋亡

DOX组心肌组织细胞凋亡率较Control组升高（P＜0.05）。Q10组、WSD-L组、WSD-H组细胞凋亡率较DOX组降低（P＜0.05）。WSD-H+ML-385组细胞凋亡率较WSD-H组升高（P＜0.05）。见图 4与表 4。

2.7 各组大鼠心肌组织Keap1-Nrf2/ARE通路蛋白表达

与Control组比较，DOX组心肌组织Keap1蛋白表达显著升高，Nrf2、HO-1表达显著降低（P＜0.05）。与DOX组相比，Q10组、WSD-L组、WSD-H组心肌组织Keap1蛋白表达降低，Nrf2、HO-1表达升高（P＜0.05）。与WSD-H组相比，WSD-H+ML-385组心肌组织Keap1蛋白表达升高，Nrf2、HO-1表达降低（P＜0.05）。见图 5与表 5。

3 讨论

研究显示，DOX可呈剂量依赖引起心脏毒性，导致心肌不可逆损伤^[12]。中医将其归属为“心悸”“胸痹”等范畴，病机主要为气阴亏虚。五参汤由太子参、沙参、苦参、玄参、丹参、黄芪等组成，方中太子参益气养阴，沙参具有益气养阴、清肺化痰的作用，苦参具有清热解毒、利尿消肿的功效，玄参清热解毒养阴，丹参活血祛瘀，黄芪补益中气，甘草益气调中，诸药合用，共奏益气养阴，清热解毒之功^[13]。现代药理学表明，苦参素可能通过抑制JAK2/STAT3通路活化，减轻炎症反应，保护心肌缺血再灌注大鼠心功能损伤^[14]。丹参酮IIA通过电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）抑制铁死亡和细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用^[15]。另有研究显示，黄芪甲苷改善脂肪酸氧化，减轻主动脉弓缩窄小鼠病理性心肌肥厚及纤维化^[16]。本研究结果显示，使用五参汤给予DOX诱导的大鼠模型治疗后，大鼠心肌病理损伤减轻，细胞凋亡减少，大鼠心功能指标LVEF、FS升高，LVIDs、LVIDd降低，血清心肌损伤标志物CK-MB、LDH、cTnI水平降低，表明五参汤可改善DOX诱导的大鼠心肌损伤与心肌重塑。

DOX可诱导过氧化氢、ROS的产生，ROS的积累会破坏氧化和抗氧化之间的平衡，导致氧化应激反应。DOX诱导的心肌损伤中，ROS的产生与氧化应激发挥重要作用^[17]。GSH-Px是体内清除ROS的关键酶，SOD是自由基清除因子，两者可反映细胞清除自由基和抗脂质过氧化的平衡，若其水平降低，体内的氧自由基增加可改变心肌细胞膜通透性，引起心肌细胞凋亡，诱导心肌损伤。Wang等^[18]研究显示，在DOX诱导的大鼠心肌损伤中，心肌组织ROS与丙二醛（MDA）水平升高，SOD水平降低。本研究结果与其具有一致性，发现五参汤可升高心肌组织SOD、GSH-Px水平，降低ROS水平，抑制心肌细胞凋亡，表明五参汤可抑制氧化应激反应，减轻DOX诱导的大鼠心肌损伤。研究显示，苦参中的苦参碱通过减少ROS的产生，改善线粒体膜电位，增强抗氧化酶系统，保护心肌细胞氧化应激损伤^[19]。丹参酮IIA提高SOD活性，降低MDA水平，从而改善心肌缺血再灌注损伤期间的氧化应激损伤^[20]。本研究与此报道类似。并发现，五参汤高剂量的治疗效果与阳性对照药物辅酶Q10的治疗效果相当，表明五参汤效果较好。

Nrf2为抗氧化反应的关键调节因子，在保护心肌细胞免受氧化应激损伤中发挥重要作用，Keap1是Nrf2的负调节因子，在正常生理条件下，Nrf2与Keap1相互作用，维持细胞质中的静止状态。在应激条件下，Nrf2与Keap1解离，转运到细胞核，与ARE结合，并激活下游蛋白如HO-1表达，减少心肌氧化应激水平，保护缺血诱导的心肌损伤^[21-22]。吴江立等^[23]研究显示，雏菊叶龙胆酮可能通过激活Nrf2/HO-1通路，抑制凋亡相关通路，来减轻DOX诱导的H9c2心肌细胞损伤。本研究中经五参汤治疗DOX诱导的大鼠后，大鼠心肌组织Keap1蛋白表达降低，Nrf2、HO-1表达升高，提示五参汤可能通过调节Keap1-Nrf2/ARE信号通路改善大鼠心肌损伤，而在高剂量的基础上给予大鼠腹腔注射Nrf2抑制剂，则减弱五参汤对DOX诱导的大鼠心肌损伤的治疗作用，证实五参汤可能通过调控Keap1-Nrf2/ARE信号通路改善大鼠心肌损伤。

综上所述，五参汤可能通过调节Keap1-Nrf2/ARE信号通路减轻阿霉素诱导的大鼠心脏毒性。然而，辅酶Q10并不是阿霉素心肌毒性的一线用药，其保护效应并不十分明确，用其作为阳性对照可能对结果客观性产生偏倚，且未单独设置ML-385单用组探讨可能影响结果准确性，因此后续会优化实验方案纳入详细分组，并采用更权威的阳性对照药物进一步探讨，以明确五参汤在改善心脏损伤方面的临床价值。