2026, Vol. 43文章信息
- 张海波, 葛雷, 陈昆, 等.
- ZHANG Haibo, GE Lei, CHEN Kun, et al.
- 鸦胆子苦素D调控AMPK/ULK1通路对膀胱癌细胞糖酵解的影响
- Effects of Bruceine D regulating the AMPK/ULK1 pathway on glycolysis in bladder cancer cells
- 天津中医药, 2026, 43(5): 613-619
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(5): 613-619
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.05.10
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文章历史
- 收稿日期: 2026-02-25
引用本文 |
膀胱癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，属中医“尿血”“癃闭”“淋证”范畴，其核心病机多责于湿热下注、瘀毒互结，治疗当以清热祛湿、化瘀解毒为主[1]。目前，吉西他滨和顺铂是临床上常用于治疗膀胱癌的化疗药物[2]，但其毒副作用和获得性耐药会降低疗效，甚至可能导致治疗失败[3]。因此，开发疗效确切、毒性更低的新型药物以改善预后迫在眉睫。鸦胆子苦素D提取自鸦胆子，性味苦寒，归大肠、肝经，能清热解毒、蚀疮杀虫，其药性恰与膀胱癌“湿热瘀毒”的核心病机契合[4]。膀胱癌进展的关键特征涉及肿瘤细胞的异常增殖并伴随糖酵解增强[5]，既往研究显示，能量代谢的核心调控因子AMP活化蛋白激酶（AMPK）可通过调控Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）介导自噬起始，进而影响肿瘤细胞增殖[6-7]，有研究表明，鸦胆子苦素D可抑制结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡[8]。鸦胆子苦素D是否通过调控该通路影响膀胱癌细胞增殖、凋亡、自噬及糖酵解等过程仍不清楚。本研究拟探讨鸦胆子苦素D对人膀胱癌T24细胞的作用及相关分子机制，以期为膀胱癌治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验细胞及动物人膀胱癌细胞系T24细胞购自中国科学院上海细胞库。4周龄雄性BALB/c裸鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司常州分公司，生产许可证号：SCXK（苏）2024-0016。所有实验流程均经本院伦理委员会审核并批准（批件号：YX-2024-273-01）。
1.2 主要试剂鸦胆子苦素D对照品（纯度≥98%，成都德思特生物技术有限公司）；AMPK激活剂（AICAR）、AMPK抑制剂（Compound C，美国MCE公司）；CCK-8试剂盒（深圳市安培生物科技有限公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（湖北百奥斯生物科技有限公司）；乳酸检测试剂盒（上海通善生物技术有限公司）；葡萄糖摄取试剂盒、RevertAidTMcDNA合成试剂盒（艾美捷科技有限公司）；丙酮酸检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；单丹磺酰戊二胺（MDC，上海金畔生物科技有限公司）；兔源一抗Beclin1、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、p-AMPK、AMPK、p-ULK1、ULK1、β-actin及羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G二抗（英国Abcam公司）。
1.3 鸦胆子苦素D干预浓度筛选分别用浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L鸦胆子苦素D处理T24细胞24 h。随后，加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h。使用酶标仪测定细胞吸光度值并计算细胞活力。
1.4 细胞分组及干预在含10%胎牛血清的DMEM培养基培养T24细胞，培养条件：37 ℃、5% CO2。待培养至对数生长期，将T24细胞随机分为膀胱癌组、鸦胆子苦素D低浓度组、鸦胆子苦素D中浓度组、鸦胆子苦素D高浓度组、AICAR组、鸦胆子苦素D高浓度+AMPK抑制剂（Compound C）组。膀胱癌组不做其他处理。鸦胆子苦素D低、中、高浓度组：分别给药0.4、0.8、1.6 μmol/L鸦胆子苦素D[9]。AICAR组：给药10 nmol/L AICAR[10]。鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组：给药1.6 μmol/L鸦胆子苦素D联合5 μmol/L Compound C[11]。给药24 h后，进行下游实验，检测指标变化。
1.5 观察指标 1.5.1 克隆形成实验检测T24细胞克隆形成数将各组T24细胞（800个细胞）接种于6 cm培养皿中，培养10 d。孵育结束后，使用甲醛固定菌落15 min。0.5%结晶紫染色30 min，随后计数细胞克隆形成数。
1.5.2 CCK-8试验检测T24细胞增殖情况将T24细胞接种于96孔板中（5×103个/孔）。按1.4各分组干预处理后，每孔加入10 μL CCK-8试剂。孵育2 h后，使用多功能酶标仪在450 nm处测量吸光度。
1.5.3 流式细胞术检测T24细胞凋亡率收集各组T24细胞，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后先加入结合缓冲液重悬细胞，再加入Annexin V-FITC和碘化丙啶避光孵育细胞15 min。以未处理组为对照，流式细胞仪FITC通道检测早期凋亡（Annexin V+/PI-），PI通道检测晚期凋亡（Annexin V+/PI+），FlowJo软件分析细胞凋亡率。
1.5.4 乳酸生成量、葡萄糖摄取量、丙酮酸生成量检测收集各组细胞上清液及细胞，利用乳酸检测试剂盒、葡萄糖摄取试剂盒、丙酮酸检测试剂盒测定细胞上清液中乳酸生成量、葡萄糖摄取量及细胞中丙酮酸生成量。
1.5.5 单丹磺酰尸胺（MDC）染色检测T24细胞自噬小体含量收集各组细胞，PBS洗涤、重悬细胞后，加入MDC染液避光孵育。经PBS洗涤去除多余染料后，使用中性树胶封片，荧光显微镜下观察染色情况。利用Image J软件定量各组细胞自噬小体相对含量。
1.5.6 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测T24细胞相关蛋白mRNA水平表达使用TRIzol试剂裂解T24细胞，获取总RNA。RevertAidTM cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。在ABI 7500 Real-Time PCR系统中使用SYBR Green Supermix试剂盒，以cDNA为模板进行qRT-PCR，检测增殖细胞核抗原（PCNA）、活化的半胱天冬酶-3（Cleaved Caspase-3）、丙酮酸激酶M2型（PKM2）、己糖激酶2（HK2）mRNA水平表达。以β-actin为内参进行归一化处理，2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。引物序列为PCNA正向：5’-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3’，反向：5’-GCACAGGTAAGGTTGCTGTTG-3’；Cleaved Caspase-3正向：5’-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3’，反向：5′-CTACAACGATCCCCTCTGAAAAA-3’；PKM2正向：5’-GCCGCCTGGACATTGACTC-3’，反向：5’-CCATGAGAGAAATTCAGCCGAG-3’；HK2正向：5’-GAGCCACCACTCACCCTACT-3’，反向：5’-CCAGGCATTCGGCAATGTG-3’；β-actin正向：5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反向：5’-CGCTCATTGCCGATAGTG -3’。
1.5.7 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测T24细胞相关蛋白表达放射免疫沉淀法（RIPA）缓冲液提取T24细胞总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白浓度。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离40 μg蛋白，并将其转移至聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶阻断膜上非特异性结合位点后，加入一抗Beclin1（1∶1 000）、LC3（1∶3 000）、p-AMPK（1∶2 000）、AMPK（1∶4 000）、p-ULK1（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000）、ULK1（1∶5 000）孵育过夜。次日，加入二抗（1∶4 000）室温孵育1 h。使用增强型化学发光底物试剂对特定信号进行可视化，Image J软件分析蛋白条带灰度值。
1.5.8 裸鼠膀胱癌移植瘤实验于BALB/c裸鼠右侧腋下皮下接种6×105个T24细胞。1周后，将裸鼠随机分配至对照组、鸦胆子苦素D组，每组5只。鸦胆子苦素D组每日腹腔注射2.5 mg/kg鸦胆子苦素D，对照组则给予等量生理盐水，每日1次，持续21 d。末次给药24 h后处死裸鼠，完整剥离瘤组织并称质量、测量体积。裂解部分瘤组织获得总蛋白，采用Western blot法检测p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达，以评估鸦胆子苦素D对AMPK/ULK1通路的潜在调控作用。
1.6 统计学方法使用GraphPad Prism 9进行统计分析。数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，并结合SNK-q事后检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 鸦胆子苦素D浓度筛选在不同浓度鸦胆子苦素D处理下，T24细胞的活力呈剂量依赖性下降，其半数抑制浓度（IC50）约为1.6 μmol/L。基于此结果，本研究后续实验选用0.4、0.8和1.6 μmol/L分别作为处理T24细胞的低、中、高浓度。见表 1。
| 鸦胆子苦素D浓度（μmol/L） | n | T24细胞活力（%） |
| 0.0 | 6 | 100.00±0.00 |
| 0.1 | 6 | 98.97±0.12* |
| 0.2 | 6 | 93.26±0.43* |
| 0.4 | 6 | 82.49±5.15* |
| 0.8 | 6 | 65.43±3.87* |
| 1.6 | 6 | 48.97±2.59* |
| 3.2 | 6 | 32.11±1.96* |
| 6.4 | 6 | 13.44±0.78* |
| 注：与0 μmol/L鸦胆子苦素D比较，P < 0.05。 | ||
与膀胱癌组比较，鸦胆子苦素D低、中、高浓度组、AICAR组细胞克隆形成数、OD450值降低（P < 0.05）；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组T24细胞克隆形成数、OD450值升高（P < 0.05）。见图 1和表 2。
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| 图 1 克隆形成实验检测T24细胞增殖的克隆形成实验 Fig. 1 Colony formation experiment for T24 cell proliferation |
| 组别 | n | 克隆形成数（个） | OD450值 | 凋亡率（%） |
| 膀胱癌组 | 6 | 326.68±17.78 | 1.26±0.13 | 4.67±0.25 |
| 鸦胆子苦素D低浓度组 | 6 | 276.65±15.57* | 1.02±0.10* | 8.95±0.51* |
| 鸦胆子苦素D中浓度组 | 6 | 221.44±10.98*# | 0.85±0.09*# | 13.67±0.78*# |
| 鸦胆子苦素D高浓度组 | 6 | 129.67± 7.86*#△ | 0.49±0.05*#△ | 20.63±1.15*#△ |
| AICAR组 | 6 | 121.33± 7.78* | 0.43±0.05* | 21.45±1.22* |
| 鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组 | 6 | 200.68±11.45▲ | 0.73±0.08▲ | 15.63±0.86▲ |
| 注：与膀胱癌组比较，*P < 0.05；与鸦胆子苦素D低浓度组比较，#P < 0.05；与鸦胆子苦素D中浓度组比较，△P < 0.05；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，▲P < 0.05。 | ||||
与膀胱癌组比较，鸦胆子苦素D低、中、高浓度组、AICAR组细胞凋亡率升高（P < 0.05）；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组细胞凋亡率降低（P < 0.05）。见图 2和表 2。
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| 图 2 流式细胞术检测T24细胞凋亡 Fig. 2 Flow cytometry detection of apoptosis in T24 cells |
与膀胱癌组比较，鸦胆子苦素D低、中、高浓度组、AICAR组细胞乳酸生成量、葡萄糖摄取量、丙酮酸生成量降低（P < 0.05）；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组细胞乳酸生成量、葡萄糖摄取量、丙酮酸生成量升高（P < 0.05）。见表 3。
| 组别 | n | 乳酸生成量（μmol/L） | 葡萄糖摄取量（μmol/L） | 丙酮酸生成量（μmol/mg） | 自噬小体相对含量（%） |
| 膀胱癌组 | 6 | 21.18±1.09 | 9.06±0.46 | 0.65±0.04 | 41.65±2.34 |
| 鸦胆子苦素D低浓度组 | 6 | 17.91±0.95* | 7.37±0.38* | 0.51±0.04* | 51.97±2.52* |
| 鸦胆子苦素D中浓度组 | 6 | 12.73±0.81*# | 5.45±0.29*# | 0.40±0.03*# | 68.89±3.57*# |
| 鸦胆子苦素D高浓度组 | 6 | 5.46±0.31*#△ | 2.12±0.13*#△ | 0.15±0.01*#△ | 90.44±5.16*#△ |
| AICAR组 | 6 | 5.26±0.29* | 1.98±0.12* | 0.11±0.02* | 91.23±5.23* |
| 鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组 | 6 | 10.62±0.63▲ | 3.89±0.20▲ | 0.34±0.04▲ | 75.67±4.14▲ |
| 注：与膀胱癌组比较，*P < 0.05；与鸦胆子苦素D低浓度组比较，#P < 0.05；与鸦胆子苦素D中浓度组比较，△P < 0.05；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，▲P < 0.05。 | |||||
与膀胱癌组比较，鸦胆子苦素D低、中、高浓度组、AICAR组自噬小体相对含量升高（P < 0.05）；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组自噬小体相对含量降低（P < 0.05）。见图 3和表 3。
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| 图 3 荧光显微镜观察T24细胞自噬小体形成（×400） Fig. 3 Autophagosome formation in T24 cells observed by fluorescence microscopy(×400) |
与膀胱癌组比较，鸦胆子苦素D低、中、高浓度组、AICAR组PCNA、PKM2、HK2 mRNA水平降低，Cleaved Caspase-3 mRNA水平升高（P < 0.05）；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组PCNA、PKM2、HK2 mRNA水平升高，Cleaved Caspase-3 mRNA水平降低（P < 0.05）。见表 4。
| 组别 | n | PCNA | Cleaved Caspase-3 | PKM2 | HK2 |
| 膀胱癌组 | 6 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| 鸦胆子苦素D低浓度组 | 6 | 0.81±0.09* | 1.26±0.11* | 0.86±0.09* | 0.76±0.08* |
| 鸦胆子苦素D中浓度组 | 6 | 0.62±0.07*# | 1.59±0.13*# | 0.67±0.07*# | 0.31±0.04*# |
| 鸦胆子苦素D高浓度组 | 6 | 0.30±0.04*#△ | 1.95±0.16*#△ | 0.39±0.04*#△ | 0.13±0.02*#△ |
| AICAR组 | 6 | 0.28±0.03* | 2.06±0.18* | 0.34±0.03* | 0.11±0.02* |
| 鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组 | 6 | 0.54±0.06▲ | 1.64±0.17▲ | 0.51±0.06▲ | 0.28±0.03▲ |
| 注：与膀胱癌组比较，*P < 0.05；与鸦胆子苦素D低浓度组比较，#P < 0.05；与鸦胆子苦素D中浓度组比较，△P < 0.05；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，▲P < 0.05。 | |||||
与膀胱癌组比较，鸦胆子苦素D低、中、高浓度组、AICAR组Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达升高（P < 0.05）；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达降低（P < 0.05）。见图 4和表 5。
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| 注：A，膀胱癌组；B，鸦胆子苦素D低浓度组；C，鸦胆子苦素D中浓度组；D，鸦胆子苦素D高浓度组；E，AICAR组；F，鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组。 图 4 Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白条带图 Fig. 4 Protein band patterns of Beclin1, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ, p-AMPK/AMPK, and p-ULK1/ULK1 |
| 组别 | n | Beclin1 | LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ | p-AMPK/AMPK | p-ULK1/ULK1 |
| 膀胱癌组 | 6 | 0.86±0.09 | 0.68±0.07 | 0.12±0.02 | 0.28±0.03 |
| 鸦胆子苦素D低浓度组 | 6 | 1.01±0.12* | 0.83±0.09* | 0.29±0.03* | 0.41±0.05* |
| 鸦胆子苦素D中浓度组 | 6 | 1.38±0.13*# | 1.12±0.14*# | 0.51±0.06*# | 0.65±0.07*# |
| 鸦胆子苦素D高浓度组 | 6 | 1.85±0.16*#△ | 1.57±0.15*#△ | 0.83±0.09*#△ | 0.90±0.08*#△ |
| AICAR组 | 6 | 1.91±0.17* | 1.65±0.16* | 0.86±0.09* | 0.92±0.08* |
| 鸦胆子苦素D高浓度+Compound C组 | 6 | 1.46±0.15▲ | 1.23±0.11▲ | 0.65±0.07▲ | 0.73±0.08▲ |
| 注：与膀胱癌组比较，*P < 0.05；与鸦胆子苦素D低浓度组比较，#P < 0.05；与鸦胆子苦素D中浓度组比较，△P < 0.05；与鸦胆子苦素D高浓度组比较，▲P < 0.05。 | |||||
与对照组比较，鸦胆子苦素D组瘤组织质量、体积均降低，瘤组织p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白升高（P < 0.05）。见图 5、图 6及表 6。
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| 图 5 肿瘤生长情况 Fig. 5 Tumer growth status |
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| 图 6 裸鼠瘤组织p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白条带图 Fig. 6 Protein banding patterns of p-AMPK/AMPK and p-ULK1/ULK1 in tumor tissues of nude mice |
| 组别 | 动物数 | 瘤质量（g） | 瘤体积（mm3） | p-AMPK/AMPK | p-ULK1/ULK1 |
| 对照组 | 5 | 0.71±0.08 | 856.67±46.58 | 0.36±0.04 | 0.11±0.02 |
| 鸦胆子苦素D组 | 5 | 0.21±0.03* | 310.15±18.89* | 0.87±0.09* | 0.54±0.06* |
| 注：与对照组比较，*P < 0.05。 | |||||
肿瘤的发生与进展伴随着代谢重编程，这一特征为癌细胞持续增殖提供了物质基础[12]。在膀胱癌中，多种代谢通路协同重塑，其中以“有氧糖酵解”较为突出[13]。即便氧气充足，肿瘤细胞仍优先选择糖酵解供能。PKM2与HK2作为糖酵解限速酶，在多种肿瘤中普遍高表达，两者协同加速糖酵解通量，既为快速增殖的肿瘤细胞提供充足ATP，又生成大量合成前体，奠定了肿瘤“Warburg效应”的分子基础[14]。此外，糖酵解过程往往伴随大量丙酮酸及乳酸生成。乳酸的积累不仅指示葡萄糖摄取旺盛，还通过酸化微环境促进侵袭和转移，更为关键的是，乳酸本身作为信号分子，可直接调控肿瘤细胞的代谢、增殖和存活[15]。因此，糖酵解代谢转变引起的乳酸生成量、葡萄糖摄取量及丙酮酸生成量变化，也是衡量肿瘤进展的重要指标之一。本研究发现，低、中、高浓度的鸦胆子苦素D均可减少T24细胞的乳酸生成量，葡萄糖摄取量及丙酮酸生成量，降低PKM2、HK2、PCNA mRNA水平，加快细胞增殖（克隆形成数、OD450值增加），同时提高细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达，这表明鸦胆子苦素D能够通过减缓糖酵解抑制T24细胞增殖，并诱导其凋亡。自噬对肿瘤细胞的增殖和凋亡具有重要调控作用，应激条件下，自噬可诱导细胞凋亡、抑制肿瘤生长[16]。最新研究显示，糖酵解生成的ATP可为自噬体形成、延伸及与溶酶体融合等步骤供能，确保自噬高效运转[17]。作为自噬起始的关键调控因子，Beclin1通过介导复合物组装启动自噬体成核；LC3经脂化修饰稳定锚定于延伸的自噬膜上，两者协同调控肿瘤细胞自噬的启动效率与通量水平，其表达及功能状态已成为评估肿瘤恶性程度及预后转归的关键指标[18]。本研究发现，不同浓度的鸦胆子苦素D均可增加T24细胞自噬小体相对含量，升高Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达，表明鸦胆子苦素D能够诱导T24细胞自噬。既往研究报道，鸦胆子苦素D可抑制肝癌细胞糖酵解及增殖，诱导宫颈癌细胞凋亡[19]。本研究与上述研究结果一致，证实了鸦胆子苦素D的抗肿瘤特性，提示鸦胆子苦素D可能是治疗膀胱癌的潜在有效药物。此外，在裸鼠移植瘤模型中，鸦胆子苦素D的治疗抑制了肿瘤生长，表现为瘤体质量和体积显著减少，从而在体内水平证实了其抗肿瘤活性。
AMPK/ULK1通路是细胞感知能量状态、启动自噬的核心枢纽，与肿瘤代谢重编程、恶性进展密切相关[20]。研究表明，激活AMPK/ULK1依赖性自噬可抑制结肠癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡[21]。本研究中，与膀胱癌组比较，AICAR组p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达升高，细胞增殖及糖酵解减弱，细胞自噬及凋亡能力增强，且AICAR为AMPK激活剂，表明激活AMPK/ULK1通路可抑制膀胱癌细胞恶性进展。此外，不同浓度的鸦胆子苦素D均可上调T24细胞p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达，推测鸦胆子苦素D可能通过激活AMPK/ULK1通路抑制T24细胞糖酵解，进而影响细胞自噬、增殖及凋亡。为验证此推测，本研究通过给药AMPK抑制剂—Compound C设置功能回复实验，结果显示，Compound C逆转了高浓度鸦胆子苦素D对T24细胞的抑制作用。体内实验数据与体外研究高度一致：鸦胆子苦素D显著上调了移植瘤中p-AMPK/AMPK和p-ULK1/ULK1的表达水平，从而在体内证实其抗肿瘤效应与激活AMPK/ULK1通路密切相关。
综上所述，鸦胆子苦素D可能通过激活AMPK/ULK1通路抑制T24细胞糖酵解、诱导细胞自噬，最终影响细胞增殖、凋亡进程。然而，必须指出的是，本研究的所有体外实验均仅基于单一人膀胱癌细胞系T24。不同膀胱癌细胞系在遗传背景、突变谱和生物学行为上存在异质性，因此，此发现可能受到细胞类型特异性的干扰，未来研究有必要在其他膀胱癌细胞系（如5637、J82等）及更复杂的临床前模型中进行验证，以进一步增强结论的可靠性。
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