2026, Vol. 43文章信息
- 陈泌链, 张栩铭, 项莹颖, 等.
- CHEN Milian, ZHANG Xuming, XIANG Yingying, et al.
- 甘姜苓术汤防治蛋氨酸胆碱缺乏饮食引起的脂肪性肝病和肌少症的药效及其作用机制研究
- Study on the mechanism of Ganjiang Lingzhu Decoction in improving metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by restoring skeletal muscle function
- 天津中医药, 2026, 43(5): 632-645
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(5): 632-645
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.05.12
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- 收稿日期: 2026-01-08
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2. 经方与现代中药融合创新全国重点实验室, 上海 200032
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）最新定义为存在一种或多种心脏代谢危险因素且没有有害乙醇摄入的脂肪性肝病[1]。此类疾病具有一系列组织学表现，轻者表现为不伴炎症或纤维化的肝细胞内脂肪蓄积，重者表现为伴坏死性炎症的肝脂肪变[2]。后者称为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），在多达20%的患者中可进展为肝硬化，目前认为MASH是隐源性肝硬化的主要病因[3]。据报道，到2030年，全球MASLD总人口预计将增加18.3%，患病率为28.4%。中国MASLD患病率的总体和相对增幅最大，估计中国的病例将从2016年的2.46亿例增加到2030年的3.14亿例，增幅为29.1%[4]。但目前MASLD的发病机制尚未完全明确[5]。
近年来多项临床研究报道MASLD与肌少症并存。在一项3 305例代谢综合征患者的流行病学研究中，739例（22.4%）[6]有肌少症。MASLD合并肌少症的患者发生肝炎和显著纤维化的风险高出2倍[7-8]。与健康人群相比，MASH患者肌少症的患病率显著增加（35.0% vs. 8.7%）[9]。最近的1项研究表明，在7年的随访中基线时骨骼肌质量低的参与者MASLD发病率增加[10]。在MASLD患者中，伴有肌少症与不良临床结果相关，包括严重肝纤维化和病死率增加。因此，低骨骼肌质量和功能受损可能是MASLD的重要危险因素。
肌少症以前被视为一种与年龄增长相关的渐进性疾病，表现为全身肌肉量减少、肌肉力量下降或肌肉生理功能减弱[11-12]。骨骼肌作为运动器官和代谢器官，占成人瘦体质量的40%~50%，在控制能量代谢中起着最关键的作用之一[13]。由于肌卫星细胞（SCs）的存在，健康肌肉具备在受到损伤或应激后能够完全恢复其功能的能力[14]。SCs是一种特殊类型的干细胞[15]，在肌肉的发育和修复过程中发挥着至关重要的作用，能够增殖、迁移到损伤部位并分化为成肌细胞，形成肌纤维，进而组成肌管[16]。一系列肌肉因子参与了这一过程，如胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、成肌分化因子（MyoD）等促进肌细胞增殖和分化，而肌肉生长抑制素（MSTN）则是肌纤维形成的强大负调节因子[17-18]。有研究表明，骨骼肌中SCs含量的降低是导致MASLD小鼠肌肉萎缩的重要因素[19]。
传统中医药治疗具有个体化、多靶点、整合效应的鲜明特色和优势，已成为MASLD治疗的重要手段之一。中医将MASLD归属于“胁痛”“肝癖”和“积聚”等病的范畴，肝脾失调作为基本病机贯穿于MASLD的每个病理阶段[20]。而肌少症在中医中归于“痿症”范畴，中医认为肌少症主要与肝、脾、胃、肾、肺的功能失调有关，其治疗需从脾论治[21]。《黄帝内经·素问》有云：“脾主运化，主身之肌肉”，脾胃健运则气血生化有源，四肢肌肉壮实有力；脾失运化则气血乏源，肌肉失养。因脾阳虚进一步导致痰湿饮停，肌肉筋脉失于濡润滋养，则加重关节肌肉屈伸不利、功能减退[22]。甘姜苓术汤（GJLZ）是经典的温中利水方，由甘草、干姜、茯苓和白术4味中药组成，这一《金匮要略》名方的组成简单却功能强大，以健脾温阳论治疾病。方中重用干姜为君，取其辛热之性，温中培土以散寒湿。再臣以甘淡性平之茯苓，与干姜相配，一热一利，热以胜寒，利以渗湿，使寒去湿消。又佐以苦温之白术，健脾燥湿，助茯苓祛湿之力[23]。研究表明GJLZ可有效改善MASLD大鼠肝脏代谢表型[24]，也可通过调节肠道菌群介导的12-十三碳烯酸抑制来改善小鼠脂肪型肝炎[25]。此外，Wu等[26]的研究证明GJLZ可能通过METTL14/N6-甲基腺苷介导的UDP葡糖苷酸转移酶家族2成员A3表达改善胆碱缺乏高脂肪饮食诱导的MASH。但目前尚不清楚GJLZ能否通过调节肌肉因子水平，增加SCs数量，改善骨骼肌功能，从而改善MASLD表型。因此，本研究拟在中医“脾主肌肉”理论指导下，探讨GJLZ对MASLD的疗效，并进一步分析其对小鼠骨骼肌中肌肉因子水平、SCs数量的调节以及肌肉功能的影响，以揭示其潜在的作用机制。研究将进一步丰富中医理论内涵，并为MASLD相关肌肉萎缩的中医药防治提供新策略。
1 主要材料与仪器 1.1 实验动物6周龄雄性C57BL/6小鼠，SPF级，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2023-0003。饲养于上海中医药大学实验动物中心，在25 ℃、45%相对湿度环境中，自由摄食饮水，适应性喂养7 d。本研究经上海中医药大学实验动物伦理委员会审查通过（伦理审查编号：PZSHUTCM2404180001）。
1.2 试剂与药物GJLZ颗粒喷干细粉（江苏康缘药业股份有限公司，批号Z210101），本研究将人鼠半数等效剂量作为低剂量，等效剂量作为中剂量，双倍剂量为高剂量；总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）生化检测试剂盒（南京建成生物有限公司，批号：A111-1-1、A110-1-1）；SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒、EvoM-MLV反转录试剂预混液（杭州艾科瑞生物科技有限公司，批号：AG11746、AG11706）。伊红染色液、苏木素染色液（上海科汇生物技术有限公司，批号分别为HEMML-OT-500、EOY-10-OT-1L）；油红O粉末（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司，批号：SHBN4938）；DAPI染色液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1006）；Myogenin抗体、IGF1抗体、GDF-8/Myostatin抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号分别为A6664、A11985、A22725）；Pax-7抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，批号为sc-81648）；Myogenin抗体（Abcam公司，批号为AB124800）；GDF-8/Myostatin抗体（Abcam公司，批号为AB124721）；兔二抗（杭州华安生物技术有限公司，批号HA1001）；GAPDH（杭州华安生物技术有限公司，批号721131）。
1.3 仪器大小鼠抓力测定仪（东方化玻北京科技有限公司，型号：YLS-13A）；全自动生化分析仪（日本Toshiba株式会社，型号：TBA-40FR）；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仪（美国ABI公司，型号：7500StepOnePLUS）；蛋白免疫印迹法（Western blot）快转仪（金斯瑞生物科技有限公司，型号：L00686）；酶标仪（美国BioTek公司，型号：SynergyH4）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：5804R）；冰冻切片机、石蜡切片机、脱水机、包埋机（德国Leica公司，型号分别为CM1950、RM2235、RM2235、EG1150H+C）；高速低温组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司，型号：KZ-Ⅲ-FP）；高内涵影像采集系统（美谷分子仪器有限公司，型号：Image X press & Meta X press）；光学显微镜（Olympas，型号：50I+FⅡGGP）。
2 方法 2.1 构建MASLD小鼠模型及分组给药将实验小鼠随机分为正常组、模型组、GJLZ低剂量组、GJLZ中剂量组和GJLZ高剂量组，每组6只。正常组给予正常饮食，模型组、GJLZ低剂量组、GJLZ中剂量组和GJLZ高剂量组给予蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食（常州鼠一鼠二生物技术有限公司，批号：19091103）4周。称取GJLZ颗粒喷干细粉（6.57 g生药/g干膏粉）适量，溶于纯水。在饮食基础上同步连续给药4周，GJLZ低剂量组、GJLZ中剂量组和GJLZ高剂量组分别给予0.5、1、2 g/（kg·d）GJLZ颗粒喷干细粉水溶液灌胃，余小鼠等量纯水灌胃。造模流程图见图 1。
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| 图 1 动物造模流程图 Fig. 1 Flow chart of animal modeling |
抓力测定仪检测各组小鼠前肢抓力，待小鼠恢复1 d后进行过夜禁食，安乐死各组小鼠，采集全血并分离血清，-80 ℃保存。收集各组小鼠的肝脏、胫骨前肌、腓肠肌，称质量、拍照。其中肌肉分取适量提取原代SCs。随后将肝脏中叶分为3份，骨骼肌3份，其中1份进行4%福尔马林溶液固定，切片后续进行石蜡切片病理染色，另取0.5 cm3肝组织冰冻切片；余两份其中一份锡纸包裹后续进行冰冻切片，用于油红O染色，两份均用液氮速冻后，置于-80 ℃保存备用。
2.3 骨骼肌原代细胞的提取分离与纯化 2.3.1 小鼠肌卫星细胞分离培养将小鼠安乐死后，浸泡于乙醇中消毒5 min，然后在无菌条件下剥开后肢皮肤，注意尽量避免小鼠毛发脱落后附着在肌肉上，可于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中冲洗。将后肢切下后去掉脂肪和骨骼，取下肌肉组织并用PBS冲洗后，于无菌平皿中用眼科剪反复剪碎至1 mm3大小。将肌肉小碎块移入15 mL离心管加入等体积PBS，1 000 r/min，10 min离心（离心半径：20 cm），弃上清液。加入组织量1/3~1/2体积的0.2%Ⅱ型胶原酶中（比例为20 mg∶10 mL生长培养基），37 ℃摇床消化1 h。1 000 r/min，10 min离心（离心半径：20 cm），弃上清液，再加入胰蛋白酶-EDTA（0.25%），37 ℃摇床消化30 min。加入等体积含20%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。细胞悬液800 r/min，3 min离心（离心半径：20 cm），然后分别经40、70和100 μm细胞筛过滤，细胞悬液离心1 000 r/min，10 min离心（离心半径：20 cm）。弃上清液，细胞沉淀用生长培养基重悬，接种于60 mm或100 mm直径培养皿内（视细胞沉淀量而定）。37 ℃、5%CO2培养箱中培养。
2.3.2 肌卫星细胞纯化及传代培养（差速贴壁法）分离出的细胞在培养箱中培养2 h，此时贴壁细胞主要为成纤维细胞，将未贴壁细胞转入新的培养皿中培养。第4天换液，去除血细胞及未贴壁的死细胞，并观察细胞生长情况。细胞生长至70%汇合时传代，弃去培养皿中培养基，PBS洗涤1~2次。加入适量胰蛋白酶-EDTA（0.25%）。显微镜下观察，细胞胞质回缩、开始变圆时用手轻拍培养皿。当绝大部分细胞脱落后，立即加入培养基终止消化。细胞悬液用枪头反复吹吸后，于1 000 r/min离心（离心半径：20 cm）10 min。弃上清液，细胞沉淀重悬，按1∶2或1∶3接种于新培养皿内。3~5 d传代1次，每次传代均差速贴壁30 min，以去除成纤维细胞。
2.4 血清生化指标检测末次给药后，采集全血并分离血清，-80 ℃保存。采用生化分析仪检测各组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。
2.5 组织病理小鼠肝脏或肌肉组织固定1周，脱水后石蜡包埋，病理切片机切取5 μm厚度的石蜡切片。苏木精-伊红（HE）染色观察肝组织病理变化，评价肝组织脂肪变、炎症和气球样变情况，并进行NAS评分，包括肝脂肪变评分、小叶内炎症评分和肝细胞气球样变评分。
2.6 油红O染色从-80 ℃冰箱取出肝组织或肌肉组织，置于液氮。OCT试剂包埋，采用冰冻切片机取8 μm厚度切片贴于载玻片，油红O染色进一步观察脂滴分布情况。
2.7 肝TC、TG水平检测取适量肝组织，乙醇匀浆后取上清液，按照试剂盒说明书检测肝组织TC、TG水平。
2.8 RT-qPCR法检测骨骼肌组织相关基因水平用TRIzol法提取肝组织和细胞总RNA，逆转录制备cDNA，RT-qPCR法检测肌肉生长抑制素（Mstn）、成肌分化抗原（Myod）、肌细胞生成素（Myog）和胰岛素样生长因子-1（Igf1）相关基因的表达水平。扩增引物由上海闪晶生物科技有限公司合成，引物序列见表 1。
| 目的基因 | 引物序列（5’-3’） | 产物长度（bp） |
| Mstn | 上游：CCATGCCTACAGAGTCTGACTTTC | 142 |
| 下游：GTAGGAGTCTTGACGGGTCTGAG | ||
| Myod | 上游：CCACTCCGGGACATAGACTTG | 109 |
| 下游：AAAAGCGCAGGTCTGGTGAG | ||
| Myog | 上游：GAGACATCCCCCTATTTCTACCA | 106 |
| 下游：GCTCAGTCCGCTCATAGCC | ||
| Igf1 | 上游：CGTCTTCACACCTCTTCTACCTG | 170 |
| 下游：CCGAATGCTGGAGCCATAG |
在RIPA裂解液中匀浆肝组织、超声碎裂细胞，蛋白质定量（BCA）法测定蛋白浓度，配制蛋白样本，高温变性备用。Western blot法检测MSTN、MyoD和IGF-1相关蛋白的表达水平。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算相关蛋白相对于内参蛋白（GAPDH）的表达量。
2.10 组织免疫荧光检测石蜡切片进行脱蜡操作，随后进行抗原修复20 min，98 ℃。PBS洗3次，3 min/次。4% BSA室温封闭1 h。滴加一抗4 ℃过夜。复温30 min，回收一抗，PBS洗3次，3 min/次。孵育荧光二抗，室温1 h，避光。PBS洗3次，3 min/次。加入DAPI，室温孵育10 min，PBS清洗3次，3 min/次。封片胶封片。
2.11 细胞免疫荧光法检测将小鼠骨骼肌SCs接种于12孔中贴壁生长，待长至90%左右，弃掉上清，PBS润洗3次。4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗3次。0.5%Triton-X透化处理15 min，PBS洗2次，5 min/次。10%BSA室温封闭2 h。滴加一抗4 ℃摇床孵育过夜。回收一抗，PBS洗2次，5 min/次。孵育荧光二抗，室温1 h，避光。PBS洗2次，5 min/次。加入DAPI，室温孵育10 min，PBS清洗5次，5 min/次。高内涵仪器拍照。
2.12 统计学方法本研究采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9.4.1软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较方差齐时使用最小显著性差异法（LSD），方差不齐时采用Games-Howell法；非正态分布数据以中位数（四分位数间距）[M（Q1，Q3）]表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Dunn’s多重比较。所有统计检验均以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 GJLZ改善小鼠MASLD表型 3.1.1 GJLZ对小鼠体质量、肝质量、肝体比的影响与正常比较，模型组小鼠体质量和肝质量降低（P＜0.05或P＜0.01），肝体比差异无统计学意义；与模型组比较，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组干预后体质量、肝质量和肝体比变化不显著。见表 2。
| 组别 | 动物数 | 体质量（g） | 肝质量（g） | 肝体比（%） | ALT（U/L） | AST（U/L） | TC（μmol/g） | TG（μmol/g） |
| 正常组 | 6 | 24.77±0.40 | 0.85±0.05 | 0.03±0.00 | 25.42± 2.87 | 102.50± 8.81 | 4.41±0.45 | 9.80±0.94 |
| 模型组 | 6 | 19.00±0.51* | 0.62±0.06** | 0.03±0.00 | 123.92±10.63** | 189.08±51.89** | 3.47±0.33 | 10.38±0.90 |
| GJLZ低剂量组 | 6 | 18.86±0.50 | 0.69±0.03 | 0.04±0.00 | 109.88±23.87 | 185.85±28.04 | 2.97±0.65 | 5.95±0.48## |
| GJLZ中剂量组 | 6 | 18.31±0.69 | 0.60±0.03 | 0.03±0.00 | 97.00±10.77## | 185.33±36.32 | 3.25±0.36 | 3.17±0.95## |
| GJLZ高剂量组 | 6 | 19.72±0.88 | 0.66±0.11 | 0.03±0.01 | 81.17±29.21## | 161.17±28.18 | 3.19±0.37 | 2.39±0.45## |
| 注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。 | ||||||||
与正常组比较，模型组小鼠的血清ALT、AST水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，GJLZ中、高剂量组的血清ALT水平显著降低（P＜0.01），GJLZ低、中和高剂量组的肝脏TG水平显著降低（P＜0.01），但肝脏TC水平无显著改变。见表 2。
3.1.3 GJLZ对肝脏组织形态学、病理学的影响与正常组相比，模型组小鼠肝脏颜色变浅，肝组织中肝索结构紊乱，中央静脉周围可见明显肝细胞水肿、气球样变和局灶性脂肪变，汇管区有炎症浸润。与模型组比较，GJLZ低、中和高剂量组小鼠肝脏颜色一定程度恢复，脂肪变和炎细胞浸润程度明显减轻，脂滴变小，数量减少。模型组肝脏病理NAS评分高于正常组（P＜0.01），GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组用药后均显著降低（P＜0.01）。见图 2。
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| 注：图A，各组小鼠肝组织形态；图B，各组小鼠肝脏HE染色和油红染色；图C，各组小鼠肝脂肪变性评分；图D，各组小鼠小叶内炎症评分；图E，各组小鼠肝细胞气球样变评分；图F，各组小鼠NAS总分。与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 2 各组小鼠肝组织形态、病理染色和NAS评分（×200） Fig. 2 Liver morphology, pathological staining of mice in each group and NAS score(×200) |
与正常组相比，模型组小鼠前肢握力显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，GJLZ低、中和高剂量组小鼠前肢握力显著恢复（P＜0.05或P＜0.01）。见表 3。
| 组别 | 动物数 | 体质量（g） | 肝质量（g） | 肝体比（%） | ALT（U/L） | AST（U/L） | TC（μmol/g） | TG（μmol/g） |
| 正常组 | 6 | 24.77±0.40 | 0.85±0.05 | 0.03±0.00 | 25.42± 2.87 | 102.50± 8.81 | 4.41±0.45 | 9.80±0.94 |
| 模型组 | 6 | 19.00±0.51* | 0.62±0.06** | 0.03±0.00 | 123.92±10.63** | 189.08±51.89** | 3.47±0.33 | 10.38±0.90 |
| GJLZ低剂量组 | 6 | 18.86±0.50 | 0.69±0.03 | 0.04±0.00 | 109.88±23.87 | 185.85±28.04 | 2.97±0.65 | 5.95±0.48## |
| GJLZ中剂量组 | 6 | 18.31±0.69 | 0.60±0.03 | 0.03±0.00 | 97.00±10.77# | 185.33±36.32 | 3.25±0.36 | 3.17±0.95## |
| GJLZ高剂量组 | 6 | 19.72±0.88 | 0.66±0.11 | 0.03±0.01 | 81.17±29.21# | 161.17±28.18 | 3.19±0.37 | 2.39±0.45## |
| 注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | ||||||||
与正常组相比，模型组小鼠腓肠肌质量显著降低（P＜0.01），腓肠肌与体质量之比无显著差异。与模型组比较，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组小鼠腓肠肌质量以及腓肠肌与体质量之比无显著差异。见表 3。
3.2.3 GJLZ对小鼠骨骼肌组织形态学、病理学的影响与正常组比较，模型组小鼠腓肠肌体积变小。与模型组相比，GJLZ低、中和高剂量组腓肠肌体积一定程度恢复。肌肉组织切片病理染色实验显示，与正常组比较，模型组小鼠腓肠肌的肌管萎缩，横切、纵切肌管面积显著减少（P＜0.01），肌间脂肪浸润。与模型组相比，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组腓肠肌肌管面积增加（P＜0.05或P＜0.01），肌间脂肪浸润减轻，呈现剂量依赖性。见图 3。
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| 注：图A，各组小鼠腓肠肌组织形态；图B，各组小鼠腓肠肌H&E染色和油红染色；图C，各组小鼠肌管相对面积。与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 3 各组小鼠腓肠肌形态及病理染色 Fig. 3 Morphology and pathological staining of gastrocnemius of mice in each group |
肌肉萎缩归因于一系列涉及蛋白质合成代谢和蛋白质分解代谢的肌肉因子的调节[27]。与正常组比较，模型组小鼠骨骼肌组织中肌肉萎缩相关因子Mstn的mRNA水平升高（P＜0.05），肌肉合成相关因子Igf1、Myog和Myod的mRNA水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比，GJLZ中剂量和高剂量组骨骼肌Mstn的mRNA水平显著降低（P＜0.01），Igf1和Myog、Myod的mRNA水平升高（P＜0.05或P＜0.01），GJLZ低剂量组相关指标无显著差异。见图 4。
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| 注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 4 各组小鼠相关mRNA表达水平比较（x±s，n=6） Fig. 4 Comparison of mRNA expression levels of mice in each group(x±s, n=6) |
与正常组比较，模型组的MSTN蛋白水平升高（P＜0.05），IGF-1、MyoD蛋白水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比，GJLZ中剂量、高剂量组骨骼肌MSTN蛋白水平降低（P＜0.05），GJLZ中剂量组IGF-1蛋白水平升高（P＜0.05），GJLZ中剂量、高剂量组骨骼肌MyoD蛋白水平升高（P＜0.01）。见图 5。
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| 注：图A中A为正常组，B为模型组，C为GJLZ低剂量组，D为GJLZ中剂量组，E为GJLZ高剂量组。与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 5 各组小鼠相关蛋白表达水平比较（x±s，n=3） Fig. 5 Comparison of expression levels of related proteins in each group(x±s, n=3) |
小鼠骨骼肌组织切片免疫荧光染色结果显示，与正常组比较，模型组小鼠骨骼肌MYOG表达水平下降。与模型组相比，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组MYOG的表达水平升高。见图 6。
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| 图 6 免疫荧光检测各组小鼠骨骼肌组织MYOG表达 Fig. 6 MYOG expression in skeletal muscle of mice in each group detected by immunofluorescence |
SCs在肌肉维持和修复中起着关键作用，PAX7是SCs的标志物[28]。免疫荧光染色显示，与对照组相比，模型小鼠骨骼肌组织切片PAX7阳性表达面积减少。与模型组相比，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组PAX7阳性表达面积升高。见图 7。
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| 图 7 免疫荧光检测各组小鼠骨骼肌组织PAX7表达 Fig. 7 PAX7 expression in skeletal muscle of mice in each group detected by immunofluorescence |
进一步分离小鼠骨骼肌组织原代SCs，MSTN和PAX7免疫荧光共定位显示，与正常组比较，模型组的SCs中MSTN表达水平升高。与模型组相比，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组骨骼肌SCs中MSTN表达水平降低。见图 8。
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| 图 8 免疫荧光检测各组小鼠骨骼肌组织原代SCs的MSTN和PAX7表达 Fig. 8 Expression of MSTN and PAX7 in primary SCs in skeletal muscle tissue of mice in each group detected by immunofluorescence |
MASLD是由多种病因或单独或协同作用引起的一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，该病的患病率正呈现与日俱增的趋势，且随着年龄的增长患病风险不断增加[29]。自1980年MASH这一疾病被提出以来，针对MASH的药物研发已开展了几十年，由于其发病机制复杂，大量新药研究失败于临床开发阶段。2024年3月14日，全球首款MASH新药，选择性甲状腺激素受体β激动剂——瑞美替罗（Resmetirom）在美国获批上市，主要用于治疗伴有临床显著肝纤维化的MASH患者[30]。该药物核心作用机制在于其对肝脏内THR-β的激活，通过选择性激活THR-β，能够促进肝脏对脂肪酸的代谢，减少脂肪在肝脏中的积累，减少肝脏中的炎症反应和纤维化过程。作为首款美国食品及药物管理局（FDA）批准的治疗MASH药物，从现有研究数据来看，Resmetirom对脂肪性肝炎和纤维化的改善作用并没有达到理想效果，有效率都不足30%，仅是从统计学效果优于安慰剂治疗组，事实上大部分接受Resmetirom治疗的患者并未奏效[31]。尽管多数MASLD患者处于单纯性脂肪肝阶段，但若治疗不及时或不当，易快速进展成MASH，进一步会演变为肝纤维化、肝硬化，并可增加罹患肝细胞癌的风险[3]。因此，开发出防治MASLD更有效的药物刻不容缓。
近年来多项临床研究报道MASLD与肌少症并存。与健康人群相比，MASH患者肌少症的患病率显著增加[32-33]。在MASLD患者中，肌肉减少症与不良临床结果相关，包括严重肝纤维化和病死率增加。因此，低骨骼肌质量可能是MASLD的重要危险因素。此外，肌肉减少症也与肝硬化有关，是肝硬化的预后决定因素[34]。
2014年亚洲肌少症工作组（AWGS）专家共识提出肌少症的定义为“与年龄有关的肌肉减少，伴随肌肉力量不足和/或身体功能下降”[35]。2016年，WHO的国际疾病分类（ICD）正式将肌少症定义为一种疾病，代码为ICD-10-CM（M62.84）。2018年欧洲老年人肌少症工作组（EWGSOP）指出低肌力成为诊断肌少症的主要决定因素。亚洲[36]、欧洲[35]、中国[37]肌少症工作组对于肌少症以下致病假说已达成共识：肌纤维丢失、萎缩，骨骼肌蛋白合成/分解代谢失衡，骨骼肌细胞凋亡增加，SCs数量的丢失和功能障碍，炎症细胞因子增加等。
与西医以单一病因和靶向药物为主的治疗方式不同，中医药注重整体观念和辨证施治，能够为患者提供个性化的治疗方案，有效应对MASLD的复杂性。中医认为，肝脏是调节气血和代谢的关键脏腑，而脾主运化吸收。肝气郁结、脾虚湿滞等病理变化会导致脂肪代谢紊乱，进而引发脂肪在肝脏的积聚[20]。脾阳主温运，负责将摄入的食物转化为气血。如果脾阳虚弱，运化功能减退，食物的消化吸收效率降低，气血生成不足。这种情况下，身体无法获得足够的营养，导致四肢肌肉的滋养不足，最终引发肌肉的萎缩和无力[38]。此外，脾阳虚还可能导致痰湿的产生。痰湿是由于脾失去运化功能而形成的病理产物，其在体内的积聚不仅影响脾的正常功能，还会阻碍气血的流通，进一步使肌肉失于濡养。当脾阳虚引发痰湿饮停时，体内的湿气会沉积在关节和筋脉中，导致肌肉和筋脉的濡润滋养受到严重影响。湿气的存在会使得关节的活动受限，出现屈伸不利的情况，甚至导致疼痛和不适。这种情况往往使得患者的活动能力下降，形成恶性循环，进一步加重肌肉的萎缩和无力感[22]。
GJLZ组成为甘草、干姜、茯苓、白术，又名肾着汤，临床主要用于治疗由脾胃虚弱、寒湿内盛导致的寒湿型腰痛、腰冷腹重和慢性肾病引起的水肿等症状[39]。现代药理学研究表明，干姜中的姜辣素可以调节TG和TC的生物合成，改善MAFLD患者的肝脂肪变性[40-41]；还可以恢复线粒体形态，减轻氧化应激，改善骨骼肌脂质代谢[42]。干姜中含有的姜辣素、姜黄素等成分具有抗炎活性，可抑制多种炎症介质的释放，减轻炎症反应[43-44]。茯苓中含有的茯苓素等成分，能够促进钠、钾、氯等电解质的排出，增加尿量，有助于改善水肿、小便不利等症状[45]。茯苓多糖可通过促进外周组织对葡萄糖的利用，抑制糖异生等途径，发挥降低血糖的作用，对糖尿病及其并发症具有一定的防治作用[46]。白术通过抑制肾小管对钠的重吸收，促进钠、钾等电解质的排出，从而增加尿量，可用于治疗水肿、小便不利等病症[47-48]。白术中含有多种抗氧化物质，如白术内酯、挥发油等，能够清除体内自由基，减少氧化损伤，延缓衰老，预防与氧化应激相关的疾病[49-50]。白术中的有效成分可促进胰岛素的分泌，提高胰岛素的敏感性，增加葡萄糖的摄取和利用，从而降低血糖水平[51-53]。有研究表明，甘姜苓术汤可有效改善MASLD大鼠和小鼠肝脏代谢表型[24-26]。但GJLZ对MASLD的改善机制以及是否对肌肉功能产生影响还有待进一步探索。
本研究建立了MCD饮食诱导的MASLD小鼠模型，予以GJLZ干预，评估其药效和作用机制。通过组织病理染色观察发现，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组均可以改善模型小鼠肝脏形态变化，减轻肝脏脂质累积和炎症；降低NAS评分，差异有统计学意义（P＜0.01）。小鼠前肢握力和肌肉病理检测等结果表明，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量组显著改善MASLD小鼠肌肉功能，减轻肌间脂肪浸润，并增加肌管面积，差异有统计学意义（P＜0.05）。肌肉萎缩归因于蛋白质合成和降解因子的失衡[54]，本研究评估了几个关键肌肉调节因子的表达。MSTN作用是抑制肌肉细胞的生长、分化和增殖，Mstn基因敲除的动物出现肌量增加[55]。模型小鼠MSTN的mRNA和蛋白表达水平显著升高，而GJLZ低剂量组没有显著差异，但GJLZ中剂量和高剂量干预之后显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。MyoD和MYOG是促进肌肉生成和分化的两个关键因子，而IGF-1可以促进肌肉、骨骼和其他组织的生长[56]，它们的表达水平在模型小鼠降低，GJLZ低剂量干预后也无显著差异，但在GJLZ中剂量和高剂量组则显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此提示GJLZ中剂量和高剂量组可能恢复了MASLD小鼠骨骼肌组织的肌肉因子水平紊乱，进而恢复了肌肉合成和肌肉萎缩平衡，从而改善肌肉萎缩。SCs是存在于骨骼肌中的一种特化干细胞，主要负责肌肉的生长、修复和再生[28, 57]。本研究通过小鼠骨骼肌组织切片免疫荧光染色发现，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量均可恢复MASLD小鼠的骨骼肌SCs数量。进一步分离各组小鼠骨骼肌SCs，细胞免疫荧光染色结果表明，GJLZ低剂量、中剂量和高剂量降低了模型小鼠SCs的MSTN表达水平，这可能是GJLZ恢复MASLD小鼠骨骼肌SCs数量的原因。
本研究采用MCD饮食诱导小鼠MASLD模型，该模型虽可通过胆碱缺乏快速诱导肝脏脂质沉积和炎症反应，但其代谢特征与人类MASLD存在差异。人类MASLD通常伴随肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等代谢综合征表现，而MCD模型由于饮食成分限制导致小鼠体质量下降，难以模拟人类MASLD的代谢紊乱特征[58]。此外，MCD饮食导致的肝脏损伤主要源于甲基供体缺乏引发的脂质代谢异常，与人类MASLD多因素致病机制（如高热量饮食、遗传易感性、肠道菌群紊乱等）存在本质区别[59]。尽管MCD模型存在局限性，但其在研究MASLD发病机制和药物干预效果方面仍具有重要价值。该模型能够快速且稳定地诱导肝脏脂肪变性和炎症反应，为研究肝脏病理变化提供了良好的实验基础[60]。本研究发现GJLZ可有效改善MCD模型小鼠肝脏脂质沉积和炎症反应，其机制可能涉及调节脂质代谢和炎症信号通路，这一结果对探索MASLD治疗策略仍具有一定参考意义。然而，在将本研究结论外推至人类MASLD时需谨慎，后续研究可结合其他更贴近人类代谢特征的模型[61]，进一步验证GJLZ的治疗效果和作用机制，以增强研究结果的临床转化价值。
本研究中GJLZ低剂量组对部分指标未表现出显著改善效果，原因可能较为复杂。首先，从药效阈值角度分析，药物发挥治疗作用通常需达到特定的血药浓度阈值，以激活或抑制相应靶点。GJLZ低剂量组设置为临床等效剂量的半量，可能未达到有效作用浓度，无法充分调节肝脏脂质代谢和肌肉合成-降解相关信号通路。例如，在调节MSTN、MyoD、MYOG及IGF-1等关键因子表达时，低剂量的GJLZ不足以突破靶点激活的阈值，导致其对肌肉因子水平紊乱的纠正能力有限。其次，靶点敏感性差异也是重要因素。不同组织细胞对药物的敏感性存在显著差异，肝脏与骨骼肌细胞内GJLZ作用靶点的表达丰度、活性状态不同，使得低剂量药物难以在两类组织中同时产生有效响应。此外，MASLD模型小鼠体内复杂的病理环境可能影响药物代谢动力学，导致低剂量药物在体内的分布、代谢异常，降低了药物到达靶点的实际浓度，削弱了其治疗效果。后续研究可通过测定GJLZ在不同剂量下的药代动力学参数，明确其在模型小鼠体内的浓度-效应关系，并结合分子生物学技术，深入探究靶点对药物的敏感性差异，为优化药物剂量和治疗策略提供更坚实的理论依据。
肝脏与骨骼肌作为机体能量代谢的重要器官，两者通过循环因子和信号通路存在紧密联系。在MASLD病理进程中，肝脏脂质代谢紊乱可释放游离脂肪酸（FFAs）、细胞因子等进入循环系统，直接影响骨骼肌功能。研究表明，肝脏过度合成的FFAs可异位沉积于骨骼肌，引发肌间脂肪浸润，干扰肌肉细胞内线粒体功能和胰岛素信号传导，最终导致肌肉萎缩和功能下降[62-63]。同时，肝脏炎症状态下释放的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等促炎细胞因子，可通过抑制MyoD、MYOG等肌肉生成关键因子的表达，促进肌肉蛋白降解，加剧肌肉功能障碍[64-65]。本研究中，GJLZ干预显著改善肝脏脂质沉积和炎症，同时增强肌肉功能，提示肝脏脂代谢改善可能通过减少有害循环因子释放，减轻其对肌肉细胞的损伤作用，间接促进肌肉修复。而肝脏脂质沉积减少后，释放至血液的FFAs降低，可减少肌间脂肪浸润，改善肌肉能量代谢。此外，肝脏作为胰岛素抵抗的重要靶器官，其功能改善或可通过调节胰岛素敏感性，间接影响骨骼肌对葡萄糖和氨基酸的摄取利用，促进肌肉蛋白合成[66]。然而，本研究尚未对循环因子水平及相关信号通路进行系统检测，肝脏与骨骼肌间的双向调控机制仍需后续研究通过检测血浆FFAs、细胞因子水平，结合转录组学和蛋白质组学技术进一步明确。
综上，研究在MCD饮食诱导的MASLD小鼠模型中明确了GJLZ对肝脏脂质沉积、炎症反应、肌肉质量和肌肉功能的改善作用。在此基础上，发现GJLZ的中剂量和高剂量均表现出显著的疗效，可能通过恢复MASLD小鼠肌肉合成与降解相关因子的平衡，下调SCs中MSTN的表达水平以增加SCs的数量，从而促进小鼠肌肉量的增加、减轻肌纤维萎缩、增强前肢握力并改善MASLD。然而，肝脏与骨骼肌之间的相互作用机制较为复杂，本研究尚未能全面阐明其机制，因此仍需进一步深入探索。
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2. National Key Laboratory of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine for Modernization of Classical Chinese Medicine, Shanghai 200032, China