2026, Vol. 43文章信息
- 井晓煦, 陈玲, 王颖, 等.
- JING Xiaoxu, CHEN Ling, WANG Ying, et al.
- 醒脑益智针刺法对阿尔茨海默病大鼠认知功能及Nrf2/HO-1信号通路的影响
- Effect of the brain-refreshing and intelligence-promoting acupuncture method on cognitive function and Nrf2/HO-1 signaling pathway in Alzheimer's disease rats
- 天津中医药, 2026, 43(5): 646-653
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(5): 646-653
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.05.13
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- 收稿日期: 2026-02-10
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2. 天津市中医药研究院, 天津 300120
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行疾病，以记忆障碍和认知功能下降为初始特征，逐步影响行为、言语和视觉，最终导致痴呆[1]，给患者家庭与社会医疗体系带来沉重负担。AD发病与淀粉样蛋白肽（Aβ）聚集[2]、线粒体结构功能异常、脂质过氧化和活性氧（ROS）积累等密切相关，且AD发生时炎症和氧化应激反应同时爆发[3]。氧化应激失衡加剧了神经细胞损伤，并调控多条疾病相关信号通路参与神经病理进程，其中Nrf2（核因子E2相关因子2）/HO-1（血红素氧合酶-1）通路作为经典抗氧化防御通路，在神经保护方面发挥着重要作用。
针刺法作为中医重要疗法，在改善老年痴呆症状、延缓疾病进展方面展现出独特优势。针灸“足三里”有效改善认知障碍，提高学习记忆能力[4]。然而目前研究多采用单一部位取穴（如仅取头部穴位或仅取四肢穴位），存在靶点单一、调控途径局限的问题，且对“头部+四肢+躯干”联合取穴调控Nrf2/HO-1通路的机制研究不足。本团队自创的醒脑益智针刺法选取“百会、水沟”等头部穴位醒脑开窍，“足三里、三阴交”等四肢穴位益气养血，“太溪、命门”等躯干穴位补肾填髓，形成“醒脑-健脾-补肾”的协同调理方案，区别于现有单一取穴策略。本研究采取侧脑室注射链脲佐菌素（STZ）法建立AD大鼠模型，初步明确醒脑益智针刺法对AD大鼠认知功能的改善作用及潜在作用机制，为醒脑益智针刺法在针刺干预AD的作用机制研究提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物选取12只6~8周龄无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠，体质量250~280 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可编号：SCXK（京）2021-0006。大鼠饲养于天津津科博纳生物科技有限公司，动物使用许可证号：SYXK（津滨）2023-0005。大鼠生存于温度20~26 ℃，湿度40%~70%的环境下，自由饮食饮水，适应性饲养7 d。本实验经过天津津科博纳生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准（审批号：GENINK-20240096）。
1.2 主要试剂与仪器主要试剂：链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，货号：S0130）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，货号：JL13202，JL13241）；β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）ELISA试剂盒，总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒，丙二醛（MDA）含量试剂盒和ROS检测试剂盒（北京津科谱析生物科技有限公司，货号：PE-0223R2，PB1020W48，PB1008W48，PB1175）；2×SYBR Green Master Mix（美国Selleck公司，货号：B21203）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo公司，货号：K1622）；兔源一抗HO-1（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：10701-1-AP）；兔源一抗Nrf2（美国CST公司，货号：#20733）；兔源一抗Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1，美国Affinity公司，货号：AF5266）；鼠源一抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，天津优抗公司，货号：UM4002）；HRP-Goat Anti-Rabbit二抗和HRP-Goat Anti-Mouse二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：RGAR001，RGAM001）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司，货号：P0011）等。
主要仪器：一次性针灸针（北京珞亚山川医疗器械有限公司）；ZS-FD/W型单臂数显脑立体定位仪（无线，北京众实迪创科技发展有限责任公司）；Morris水迷宫视频分析系统（上海吉量软件科技有限公司）；SpectraMax M5型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；ABI7500型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）；Tanon 5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）等。
1.3 实验分组与AD造模12只SPF级健康雄性大鼠随机分为4组，对照组、假手术组、模型组和针刺组，每组3只大鼠。其中模型组和针刺组大鼠按照褚文政等[5]方法建立AD大鼠模型。手术前需禁食12 h，麻醉后固定在脑立体定位仪上，确定打孔坐标：前囱后1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm，脑表面下3.5 mm，向大鼠每侧侧脑室注射5 μL的STZ（3 mg/kg）。术后2 d连续腹腔注射青霉素，第3天重复注射STZ，术后保暖防感染。假手术组则注射等量的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，对照组大鼠不做处理，正常饲养。造模结束后，分别从对照组和模型组中各取1只大鼠眼球取血，使用ELISA法检测血清Aβ1-42水平，当模型组血清Aβ1-42水平显著高于对照组时，判定AD模型构建成功。
1.4 动物干预方法造模成功后，针刺组大鼠取双侧百会、水沟、印堂、四神聪、足三里、三阴交、太溪和命门穴位，穴位定位参照《实验动物针灸穴位图谱》。使用0.25 mm×3 mm的无菌毫针，所有穴位均垂直进针2~3 mm，进针深度由针身刻度标识进行统一把控；留针时长15 min，间隔5 min行针1次，行针手法为标准平补平泻，捻转频率为120~150次/min，捻转角度维持在90~180 °。所有针刺操作由3年以上实验动物针灸经验的同一人员完成，以确保行针操作的一致性。7 d为1个疗程，治疗6 d天休息1 d，共4个疗程。对照组、假手术组及模型组大鼠常规饲养，不做任何干预处理。
1.5 观察指标及方法 1.5.1 Morris水迷宫检测大鼠认知功能Morris水迷宫实验主要用于检测啮齿动物对空间和方向的学习和记忆能力，广泛应用于AD和帕金森病等神经退行性疾病的研究中[6]。针灸治疗结束后，对所有大鼠进行Morris水迷宫检测，主要包括定向航行实验与空间探索实验两个部分：定向航行实验前将大鼠放置于站台上适应30 s，每天将大鼠随机从不同象限贴壁置于池中，若大鼠能成功找到站台则停止记录，游泳时长记录为逃避潜伏期。若大鼠在60 s内未能找到站台，则引导其登上站台休息15 s，则大鼠逃避潜伏期记录为60 s。实验持续4 d，每天每只大鼠检测4次，取平均值，且每次测试间隔时间为1 h。实验第5天进行空间探索实验，撤出平台，将大鼠从原平台所在象限（目标象限）的对面象限放入水中，记录120 s内大鼠跨越平台次数和目标象限停留时间。
1.5.2 ELISA法检测血清TNF-α和IFN-γ水平及海马组织Aβ1-42含量采集大鼠腹主动脉血样和海马组织，血样经离心后收集血清，海马组织经匀浆后制备成组织匀浆备用。分别使用TNF-α和IFN-γ的ELISA试剂盒检测大鼠血清TNF-α和IFN-γ水平，Aβ1-42的ELISA试剂盒检测大鼠海马组织中Aβ1-42的含量。简而言之，用捕获抗体包被样品孔，孵育过夜后进行封闭和加样，随后用检测抗体和二抗孵育，加入显色液后用酶标仪检测吸光度。根据标准品制备的标准曲线计算TNF-α、IFN-γ和Aβ1-42水平。
1.5.3 比色法检测额叶和海马组织MDA、ROS及海马组织T-AOC水平分别取大鼠额叶组织和海马组织，匀浆后收集上清，分别加入MDA、T-AOC反应试剂和ROS探针孵育，用酶标仪检测：MDA和T-AOC，520 nm和532 nm处测吸光度并按公式和标准曲线计算浓度；ROS，488 nm激发波长，525 nm发射波长下测荧光值。
1.5.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测额叶和海马组织Nrf2、HO-1及海马组织Keap1的mRNA表达水平分别取大鼠额叶组织和海马组织，液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱。使用Trizol试剂提取总RNA，并检测其纯度与完整性。按试剂说明书将RNA逆转录合成cDNA，以cDNA为模版，加入SYBR Green Master Mix和引物，设置反应程序：94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，30 s；共循环40次。以GAPDH作为对照进行标准化，采用2-ΔΔCT方法计算mRNA表达量。引物序列见表 1。
| 基因名称 | 序列（5’-3’） | 长度（bp） |
| Keap1 | 上游：GTGCTCAACCGCTTGCTGTATG | 242 |
| 下游游：ACGAAAGTCCAGGTCTCTGTCTCC | ||
| Nrf2 | 上游：CAGCACATCCAGACAGACACCAGT | 166 |
| 下游游：GGGCAAGCGACTGAAATGTAGG | ||
| HO-1 | 上游：CAGGCACTGCTGACAGAGGAAC | 179 |
| 下游游：AAACTGAGTGTGAGGACCCATCG | ||
| GAPDH | 上游：TTCAGCTCTGGGATGACCTT | 129 |
| 下游：TGCCACTCAGAAGACTGTGG |
分别取大鼠额叶组织和海马组织，液氮速冻，加入RIRP裂解缓冲液提取总蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白质浓度。蛋白质提取物用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移到PVDF膜，使用5%脱脂奶粉溶液进行封闭。加入6 μL一抗（HO-1和Nrf2，稀释比例均为1∶1 000；Keap1，稀释比例为1∶500；GAPDH，稀释比例为1∶2 000），在4 ℃下孵育过夜，然后与二抗（HRP-Goat Anti-Rabbit和HRP-Goat Anti-Mouse，稀释比例均为1∶4 000）在室温下孵育1 h。显色后放入全自动化学发光图像分析系统内成像，拍照。使用灰度值软件Gelpro32对条带进行灰度值分析。
1.6 统计学方法使用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。所有实验数据经过Shapiro-Wilk检验方法验证正态性，Levene检验方法验证方差齐性，符合正态分布且方差齐性的指标采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；若数据不符合正态分布或方差齐性则使用非参数性检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 醒脑益智针法改善AD大鼠空间学习能力第1天，与对照组比较，假手术组和模型组逃避潜伏期升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，针刺组逃避潜伏期降低（P＜0.05）。在第2~4天时，与对照组比较，假手术组逃避潜伏期无显著变化（P>0.05），模型组逃避潜伏期升高（P＜0.05或P＜0.01）；与假手术组比较，模型组逃避潜伏期升高（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组逃避潜伏期降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表 2。
| s | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 1 d | 2 d | 3 d | 4 d | ||||||||||||||||||||||||
| 对照组 | 3 | 13.94±12.37 | 4.48±1.57 | 4.53±1.34 | 3.67± 1.07 | ||||||||||||||||||||||||
| 假手术组 | 3 | 37.07± 3.21* | 3.80±0.58 | 3.22±0.61 | 3.06± 0.87 | ||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 3 | 50.27± 6.49** | 54.23±6.26**## | 46.60±11.84*## | 52.45±13.09**## | ||||||||||||||||||||||||
| 针刺组 | 3 | 27.04±17.05△ | 14.22±6.38△△ | 13.77±11.6△ | 7.82± 4.64△ | ||||||||||||||||||||||||
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
空间探索轨迹图显示，对照组和假手术组轨迹路线相对规律；模型组轨迹分散，移动路线杂乱无章，导向性弱；针刺组轨迹向目标象限聚集，散乱程度较模型组有所改善。假手术组跨越平台次数和目标象限停留时间与对照组无显著差异（P>0.05）；与对照组和假手术组比较，模型组跨越平台次数和目标象限停留时间均减少（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组跨越平台次数和目标象限停留时间增加（P＜0.05）。见图 1，表 3。
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| 图 1 各组大鼠的空间探索轨迹图 Fig. 1 Spatial exploration trajectory map of rats in each group |
| 组别 | 动物数 | 跨越平台次数（次） | 目标象限停留时间（s） |
| 对照组 | 3 | 7.00±2.65 | 64.71±17.12 |
| 假手术组 | 3 | 6.00±2.00 | 64.83±11.12 |
| 模型组 | 3 | 1.33±0.58*# | 35.96±6.62*# |
| 针刺组 | 3 | 4.00±2.00△ | 51.85±3.64△ |
| 注：与对照组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。 | |||
模型组TNF-α和IFN-γ水平高于对照组和假手术组（P＜0.01）；针刺组TNF-α和IFN-γ水平低于模型组（P＜0.01）。见表 4。
| pg/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | TNF-α | IFN-γ | ||||||||||||||||||||||||||
| 对照组 | 3 | 99.62±2.60 | 63.18±4.83 | ||||||||||||||||||||||||||
| 假手术组 | 3 | 99.87±3.69 | 65.90±3.52 | ||||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 3 | 162.55±6.65**## | 104.46±4.83**## | ||||||||||||||||||||||||||
| 针刺组 | 3 | 125.59±6.35△△ | 82.56±3.66△△ | ||||||||||||||||||||||||||
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
模型组大鼠额叶组织MDA和ROS水平高于对照组和假手术组（P＜0.01）；针刺组大鼠额叶组织MDA和ROS水平低于模型组（P＜0.01）。见表 5。
| 组别 | 动物数 | MDA（nmol/mg·prot） | ROS（荧光值） |
| 对照组 | 3 | 0.75±0.20 | 164.15±10.73 |
| 假手术组 | 3 | 0.67±0.26 | 166.99± 6.86 |
| 模型组 | 3 | 2.22±0.29**## | 270.61± 6.58**## |
| 针刺组 | 3 | 1.12±0.09△△ | 211.35± 8.74△△ |
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。 | |||
模型组大鼠海马组织Aβ1-42、MDA和ROS水平高于对照组和假手术组（P＜0.05或P＜0.01），而T-AOC水平低于对照组和假手术组（P＜0.01）；针刺组大鼠海马组织Aβ1-42、MDA和ROS水平低于模型组（P＜0.05），T-AOC水平高于模型组（P＜0.01）。见表 6。
| 组别 | 动物数 | Aβ1-42（ng/mg prot） | T-AOC（μmoL/mg prot） | MDA（nmol/mg prot） | ROS（荧光值） |
| 对照组 | 3 | 10.34±0.83 | 0.40±0.01 | 15.96±0.88 | 2 867.91± 60.44 |
| 假手术组 | 3 | 10.32±0.72 | 0.38±0.04 | 15.35±1.65 | 2 971.17±162.98 |
| 模型组 | 3 | 31.03±2.03*## | 0.12±0.02**## | 45.25±4.57*## | 9 153.96±198.47**# |
| 针刺组 | 3 | 19.57±0.90△ | 0.25±0.02△△ | 30.46±2.09△ | 6 073.75±365.39△ |
| 注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 | |||||
模型组大鼠额叶组织和海马组织中Nrf2和HO-1的mRNA表达水平低于对照组和假手术组（P＜0.05或P＜0.01），该组大鼠海马组织中Keap1的mRNA表达水平高于对照组和假手术组（P＜0.01）；针刺组大鼠额叶组织和海马组织中Nrf2和HO-1的mRNA表达水平高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），而海马组织中Keap1的mRNA表达水平低于模型组（P＜0.01）。见表 7，表 8。
| 组别 | 动物数 | Nrf2 | HO-1 |
| 对照组 | 3 | 1.01±0.17 | 1.02±0.21 |
| 假手术组 | 3 | 0.99±0.15 | 1.01±0.16 |
| 模型组 | 3 | 0.50±0.08**## | 0.30±0.03**## |
| 针刺组 | 3 | 0.66±0.08△ | 0.71±0.08△△ |
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 | |||
| 组别 | 动物数 | Keap1 | Nrf2 | HO-1 |
| 对照组 | 3 | 1.01±0.12 | 1.01±0.14 | 1.01±0.13 |
| 假手术组 | 3 | 1.04±0.11 | 1.03±0.17 | 0.95±0.17 |
| 模型组 | 3 | 2.14±0.11**## | 0.48±0.02**## | 0.40±0.05**# |
| 针刺组 | 3 | 1.49±0.19△△ | 0.68±0.15△ | 0.78±0.08△△ |
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 | ||||
模型组大鼠额叶组织和海马组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平低于对照组和假手术组（P＜0.05或P＜0.01），海马组织中Keap1的蛋白表达水平高于对照组和假手术组（P＜0.01）；针刺组大鼠额叶组织和海马组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），而海马组织中Keap1的蛋白表达水平低于模型组（P＜0.01）。见图 2，图 3，表 9，表 10。
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| 注：A，对照组；B，假手术组；C，模型组；D，针刺组。 图 2 各组大鼠额叶组织Nrf2和HO-1的蛋白表达情况 Fig. 2 Protein expression of Nrf2 and HO-1 in the frontal lobe tissues of rats in each group |
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| 注：A，对照组；B，假手术组；C，模型组；D，针刺组。 图 3 各组大鼠海马组织Keap1、Nrf2和HO-1的蛋白表达情况 Fig. 3 Protein expression of Keap1, Nrf2 and HO-1 in the hippocampus of rats in each group |
| 组别 | 动物数 | Nrf2/GAPDH比值 | HO-1/GAPDH比值 |
| 对照组 | 3 | 0.43±0.02 | 0.42±0.04 |
| 假手术组 | 3 | 0.42±0.03 | 0.42±0.03 |
| 模型组 | 3 | 0.26±0.03**# | 0.25±0.03**## |
| 针刺组 | 3 | 0.33±0.01△ | 0.33±0.03△ |
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。 | |||
| 组别 | 动物数 | Keap1/GAPDH比值 | Nrf2/GAPDH比值 | HO-1/GAPDH比值 |
| 对照组 | 3 | 0.28±0.01 | 0.57±0.03 | 0.55±0.03 |
| 假手术组 | 3 | 0.27±0.01 | 0.57±0.03 | 0.53±0.02 |
| 模型组 | 3 | 0.52±0.03**## | 0.3±0.03**## | 0.27±0.02**## |
| 针刺组 | 3 | 0.38±0.01△△ | 0.43±0.04△△ | 0.39±0.03△△ |
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。 | ||||
AD因其以进行性认知功能障碍、记忆力减退为主要特征，故归属于中医“痴呆、健忘”范畴，其核心病机为髓海空虚、神机失用。肾与脑的关系在中医理论中关系尤为紧密，《医方集解》中指出“人之精与志，皆藏于肾，肾精不足则志气衰，不能上通于心，故迷惑善忘也”。醒脑益智针刺法紧扣病因机理，从经络理论看，督脉入脑络肾，醒脑益智针刺法关键靶点穴位选在头部，百会为诸阳之会，针刺可提升清阳、贯通脑髓，振奋脑神，四神聪围绕百会，四穴协同增强局部气血运行，可有效改善记忆力及认知功能，水沟、印堂位于督脉循行线，调节督脉气血，启闭开窍，宁心安神。其次，足三里、太溪、命门、三阴交四穴配伍，构建“滋阴补阳，充养髓海”的治疗大法。足三里，胃之合穴，“合治内府”，行气通络、健脾化痰，升阳化浊，醒神开窍。太溪为肾之原穴，滋补肾阴，命门温肾阳以鼓动激发肾气，太溪与命门两穴相配，一阴一阳，水火相济，调和肾之阴阳平衡，髓海得以充养。三阴交调和肝脾肾三阴经，促进气血生化。诸穴协同，醒脑益智，使五脏六腑精气上达于脑，神明得养，精神乃旺。从而从根源上改善AD大鼠髓海肾虚空虚之病理基础，为脑神功能恢复提供气血保障。
本研究发现模型组大鼠逃避潜伏期均高于其他3组，而经过醒脑益智针刺法治疗后，大鼠逃避潜伏期明显缩短，提示醒脑益智针刺法可能提高AD大鼠的学习能力。撤出平台后，模型组大鼠跨越平台次数和目标象限停留时间均减少，经过针刺治疗后，大鼠跨越平台次数增加，目标象限停留时间延长，表明醒脑益智针刺法可有效提高AD大鼠空间记忆能力。这与之前的研究结果一致[7-8]。另外，本研究发现模型组大鼠海马组织中Aβ1-42含量升高，而针刺组大鼠海马组织中Aβ1-42含量降低，说明醒脑益智针法可下调Aβ1-42的异常高表达。
神经炎症在AD模型的发病机制中起到重要作用，与AD模型病理相关的神经炎症已被广泛证实，其中促炎细胞因子的研究越来越多。余泳波等[9]研究发现与正常大鼠相比，AD模型大鼠海马组织中MDA、TNF-α和IL-1β表达明显增加。研究发现，AD患者血糖血脂以及炎性细胞因子TNF-α等临床指标均高于正常健康人群[10]。Li等[11]从小胶质细胞调节神经炎症的角度探讨了电针对AD动物模型的潜在神经保护作用，发现电针治疗可通过上调海马TREM2的表达，减少促炎因子IL-1β和TNF-α的产生，从而改善学习和记忆能力保护神经元。炎症反应通常与氧化应激反应同时发生，两者共同作用导致认知功能障碍，加重AD的发生和进展。临床医学研究发现补肾益智方联合针法可提高AD患者机体抗氧化应激能力，具体表现为血清还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧歧化酶（SOD）水平显著升高，MDA水平显著降低[12]。这与课题组研究结果一致，针刺组大鼠促炎因子TNF-α和IFN-γ水平以及氧化应激指标ROS和MDA水平均低于模型组。同时，针刺组大鼠海马组织中T-AOC水平高于模型组，表明醒脑益智针刺法可降低促炎因子表达，抑制氧化应激反应的异常激活并提高抗氧化能力，从而改善AD大鼠认知功能障碍。
Nrf2由NFE2L2基因编码，是细胞对氧化应激反应的主要调节因子。Nrf2的激活可诱导受抗氧化反应元件（ARE）调控的一系列细胞保护酶、抗氧化酶及相关蛋白表达的转录调控[13-14]。此外，Nrf2通路的激活可减少淀粉样蛋白的分泌、使细胞因子释放正常化并增加细胞中GSH的分泌[15]。然而，Keap1作为Nrf2的负向调控因子。当细胞受到外界刺激时，Keap1与Nrf2的结合能力降低，游离的Nrf2会异位到细胞核内，与ARE序列特异性结合，启动下游靶基因（如HO-1）的转录表达，从而增强细胞的抗氧化防御能力[16]。HO-1是一种重要的降解促氧化剂血红素的酶，可在压力条件下催化细胞血红素降解为抗氧化分子如胆绿素和胆红素等，促进合适的组织氧化还原微环境的恢复[17]。Nrf2/HO-1信号通路的激活在AD中发挥关键病理作用，可改善AD发生发展。可卡因和苯丙胺调节的转录物（CART）肽激活Nrf2/HO-1信号通路，减轻氧化应激损伤，进而改善AD大鼠空间记忆和运动能力[18]。冰菖散可以激活Nrf2/HO-1信号通路，上调Nrf2和HO-1的mRNA表达，同时调节铁死亡维持细胞内铁稳态平衡，从而改善AD小鼠认知功能障碍[19]。丹皮酚可降低Aβ诱导的海马组织氧化应激水平，增加AD大鼠海马组织中Nrf2和HO-1蛋白的表达，发挥改善AD大鼠学习记忆能力的作用[20]。本研究发现，醒脑益智针刺法可上调Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表达，下调Keap1的mRNA和蛋白表达，减少炎症反应和氧化应激，改善AD大鼠认知障碍，这与最近一项关于卒中后抑郁（PSD）的研究结果一致[21]。
结合现有研究及本实验结果可见，Nrf2/HO-1信号通路作为脑内抗氧化防御的核心通路，其表达下调是AD大鼠氧化应激损伤、神经炎症激活的重要分子诱因；而Keap1的异常高表达会通过抑制Nrf2核转位，进一步阻断下游HO-1的抗氧化作用，从而形成“Keap1升高-Nrf2/HO-1通路抑制-氧化应激/炎症加剧-认知功能下降”的病理连锁反应。这提示AD的脑内病理损伤并非单一环节的异常改变，而是氧化应激与神经炎症的相互交织、相互促进，并通过信号通路级联调控形成的复杂病理网络，精准调控该病理网络将为改善AD认知损伤提供有效干预思路。醒脑益智针刺法凭借多穴位的协同作用，从转录和蛋白水平双重下调Keap1表达，解除其对Nrf2的抑制效应，促进Nrf2入核并启动HO-1表达，进而提高脑内总抗氧化能力，减少MDA、ROS的蓄积，同时抑制TNF-α、IFN-γ等促炎因子释放，实现对氧化应激和神经炎症的双重调控，最终逆转AD大鼠的认知功能损伤。这一调控模式印证了针刺疗法“多靶点、多途径”干预疾病的特点，与中医“整体调理”的理论相契合，为针刺干预神经退行性疾病的分子机制研究提供了新的实验支撑。
综上所述，醒脑益智针刺法可有效改善AD大鼠空间学习记忆能力，其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激损伤有关。本研究为醒脑益智针法用于AD的治疗提供实验依据，但受限于研究尚处于初级探索阶段，且样本量有限可能降低统计效力，存在一定局限性。后续研究将进一步扩大样本量以提升数据可靠性，并通过构建体内Nrf2抑制剂干预模型及体外Nrf2基因沉默（si-Nrf2）细胞体系，深度挖掘醒脑益智针刺法对Nrf2/HO-1信号通路调控的特异性与分子机制，为临床应用奠定理论基础。
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