2026, Vol. 43文章信息
- 彭丽丽, 邓文雯, 姜如, 等.
- PENG Lili, DENG Wenwen, JIANG Ru, et al.
- 透骨血竭散含药血清通过阻断PI3K/AKT信号抑制人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的恶性行为
- Medicinal serum of Tougu Xuejie Powder inhibiting the malignant behavior of human rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by blocking the PI3K/AKT signaling pathway
- 天津中医药, 2026, 43(5): 654-661
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(5): 654-661
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.05.14
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文章历史
- 收稿日期: 2026-02-05
引用本文 |
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病[1]，病理机制涉及滑膜成纤维细胞（FLS）的异常增殖、促炎因子分泌等，最终导致关节软骨和骨的不可逆破坏[2]。尽管非甾体抗炎药、糖皮质激素及抗风湿药如甲氨蝶呤可部分缓解症状，但仍有30%~50%患者因药物耐受性差或疗效不足进展至中重度残疾，凸显了探索新型治疗策略的紧迫性[3]。近年来，靶向细胞信号通路成为RA治疗的研究热点。其中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号轴在FLS的存活、增殖及自噬调控中发挥关键作用[4]。生理状态下，该通路通过磷酸化级联反应调控细胞代谢和稳态；而在RA病理环境中，过度激活的PI3K/AKT信号可促进炎症因子[如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）]的分泌，并诱导FLS向侵袭性表型转化，形成“炎症-增殖-破坏”的恶性循环[5]。这些证据表明，靶向PI3K/AKT信号轴为阻断RA病理进程提供了潜在靶点。中医药在RA治疗中具有独特优势，其多靶点、多途径的调控机制可弥补单靶点药物的局限性。透骨血竭散作为传统骨伤科验方，以透骨草、血竭、乳香等为核心组方，具有活血化瘀、通络止痛、消肿生肌的功效。然而，透骨血竭散对RA滑膜炎症及FLS恶性行为的调控机制尚未完全阐明，尤其是其含药血清对PI3K/AKT信号轴的干预作用缺乏系统研究。本研究以RA-FLS为研究对象，从细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等维度，探讨透骨血竭散含药血清对PI3K/AKT信号轴的调控作用，为中医药现代化及新型抗风湿药物研发提供理论依据。
1 资料与方法 1.1 主要试剂与仪器人原代类风湿关节炎滑膜成纤维（RA-FLS）细胞（货号：HUM-iCell-s010RA）和人RA-FLS专用培养基（货号：iCell-s010RA-002h）均购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。Transwell小室（货号：22521040）和Matrigel（货号：356234）均购自Corning。0.1%结晶紫溶液（货号：G1063）购自北京索莱宝科技有限公司。PI3K激动剂740Y-P（货号：1236188-16-1）购自上海陶素药业有限公司。胰蛋白酶购自武汉普诺赛生命科技有限公司。CCK-8试剂盒（货号：C0038）及增强型化学发光液（ECL，货号：P0018S）、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1062L）、细胞裂解液（货号：P0013）和BCA试剂盒（货号：P0009）均购自上海碧云天生物技术有限公司。一抗PI3K（货号：20584-1-AP）、AKT（货号：60203-2-Ig）、p-AKT（货号：66444-1-Ig）、乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR，货号：28273-1-AP）、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR，货号：28879-1-AP），二抗山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（货号：SA00001-2）、山羊抗鼠IgG（货号：SA00001-1）、内参β-actin（货号：20536-1-AP）均购自Proteintech。一抗p-PI3K（货号：CSB-PA000712）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β，货号：CSB-RA216259A0HU），磷酸化的糖原合成酶激酶-3β（p-GSK-3β，货号：CSB-RA009963 A09phHU），IL-6（货号：CSB-E04638h）、TNF-α（货号：CSB-E04740h）、白细胞介素-1β（IL-1β，货号：CSB-E08053h）和白细胞介素-10（IL-10，货号：CSB-E04593h）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。
HCL-500恒温培养箱购自江苏新春兰科学仪器有限公司。EYELAFDU-2110冻干机购自东京理化器械公司、微量离心机购自美国赛默飞世尔生物科技有限公司、ELX800酶标仪购自上海碧云天生物技术有限公司、流式细胞仪购自Aceabio公司。Image J软件购自美国国立卫生研究院。倒置显微镜购自Olympus。
1.2 透骨血竭散组成药物及含药血清制备透骨血竭散由透骨草10 g，桂枝10 g，青风藤9 g，白芥子6 g，补骨脂10 g，土鳖虫6 g，当归10 g，艾叶10 g，白芍6 g，血竭6 g，红花6 g，忍冬藤10 g等组成[6]，所有中药材均购自长沙市第三医院。冻干粉制备工艺如下[7]：药材加10倍量水煎煮2次（每次1.5 h），合并滤液浓缩至1 g/mL后，经预冻（-40 ℃，2 h）、升华干燥（-20 ℃，12 h）、解析干燥（25 ℃，6 h）制成冻干粉，含水量≤5%。从湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK（湘）2024-0009]，订购SD大鼠20只，6~8周龄，雄性，体质量180~200 g，于SPF条件下饲养。分组如下：干预组为10只，每日定时接受透骨血竭散冻干粉溶液灌胃处理，给药周期持续7 d，剂量设定为9.6 g/kg[7]。空白组为10只，同期施以等体积蒸馏水灌胃，连续7 d，每日进行体质量监测并详细记录。第7天给药0.5 h后，大鼠采用异氟烷气体进行麻醉处理，经腹主动脉采集全血样本至15 mL离心管中；血样采集后室温静置30 min，随后使用低温离心机（4 ℃条件下）以3 000 r/min转速，离心半径：8 cm，离心15 min，分离获取上层血清。将治疗组血清样本充分混匀后合并，对照组血清单独收集；0.22 μm过滤器过滤后置于56 ℃水浴30 min，进行灭活；灭活后的血清分别以1 mL/管分装于1.5 mL微型离心管，于-80 ℃冰箱保存。血清经微生物检测无菌生长，内毒素含量＜0.25 EU/mL，-80 ℃保存稳定性良好（RSD＜10%）。动物实验已通过武汉珞宾生命科技有限公司实验动物福利伦理委员会批准（LBSM2024071）。
1.3 细胞培养人RA-FLS在人RA-FLS专用培养基中培养，置于37 ℃，5% CO2，饱和湿度的恒温培养箱中。收集第3代对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化，以1×105个细胞/孔的密度接种于96孔板中。在达到70 %~80 %的细胞汇合后，收集细胞用于进一步实验。
1.4 细胞处理与分组人RA-FLS细胞共分为以下几组：A组（对照组）、B组[模型组，脂多糖（LPS）诱导炎症微环境]、C组（LPS+15%透骨血竭散组）、D组[LPS+15%透骨血竭散+PI3K激活剂（740 Y-P）组]。其中，A组、B组为15%正常大鼠血清；C组用15%透骨血竭散含药血清预先处理24 h；D组预先用含10 μmol/L 740 Y-P的15%透骨血竭散含药血清处理24 h[8-9]。随后，B组、C组、D组加入最终浓度为100 ng/mL的LPS，继续培养24 h[10]。
1.5 CCK-8检测细胞活力每组细胞接种于96孔培养板，密度为1×105个/孔，并将板置于37 ℃，100%空气的培养箱中进行预培养。研究设定了5个不同浓度梯度的透骨血竭散大鼠含药血清处理组，其浓度分别为总体积的0%、5%、10%、15%及20%。同时，为保证实验条件的均衡性，向各组补充相应体积的未添加透骨血竭散的空白组大鼠血清，确保各处理组完全培养基中大鼠血清的终浓度统一维持在20%。经磷酸缓冲盐溶液（PBS）缓冲液冲洗细胞3次后，将细胞分别置于含不同浓度透骨血竭散大鼠含药血清的完全培养基中，继续培养12、24及48 h后，使用CCK-8试剂盒检测细胞活力：向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育1~4 h。使用ELX800酶标仪测定样品在450 nm波段水平上的吸光度。
1.6 流式细胞术通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的凋亡情况。简而言之，0.25%胰蛋白酶消化离心收集各组细胞，PBS洗涤3次，结合缓冲液重悬细胞。按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的说明，Annexin V-FITC和PI在室温避光条件下孵育细胞15~20 min，1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.7 划痕实验检测细胞迁移取对数生长期的RA-FLS细胞，待生长融合达到80%后，使用无菌移液管尖端在培养孔底部垂直标记3道等距平行划痕。随后用PBS反复冲洗3次，以彻底去除脱落的悬浮细胞。拍下3条划痕照片，获取初始时刻（0 h）及处理48 h后的划痕区域影像，每个时间点随机选取3个视野进行拍摄。采用Image J图像分析软件对划痕区域进行定量分析。划痕愈合率（%）=[（0 h面积-48 h面积）/0 h面积]×100%。
1.8 Transwell检测细胞侵袭Transwell小室检测细胞的迁移侵袭能力，用预填有Matrigel matrix的Transwell室进行细胞侵袭评估。实验前细胞在无血清培养基中饥饿24 h，然后在含1% FBS的培养液中重悬。上室接种1×105个细胞，然后在下室中添加600 μL含10% FBS的完全培养基。孵育24 h后，用棉签擦拭除上室中未穿过的细胞，4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色。使用倒置显微镜，随机选取5个视野观察并计数细胞数量，取平均值。
1.9 ELISA检测采用ELISA试剂盒检测细胞上清液炎性因子水平，包括促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和抗炎因子（IL-10）水平。
1.10 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测收集细胞，加入裂解液提取蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将50 μg的蛋白质经常规分离、转膜、封闭后，分别加入一抗PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、mTOR（1∶4 000）、p-GSK-3β（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）℃下过夜。然后与二抗山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG在室温下孵育1 h，ECL工作液显影。以β-actin（1∶2 000）为内参，采用Image J软件对各组条带进行灰度定量。所有实验重复3次。
1.11 统计学方法采用GraphPad Prism 9.5.0分析数据，采用Shapiro-Wilk检验法进行正态分布检验，所有数据均符合正态分布，计量资料采用均数±标准差（x±s）的形式表示，多组间采用one-way ANOVA分析，事后检验采用Tukey’s multiple comparisons test，均以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 透骨血竭散含药血清干预RA-FLS细胞的最佳浓度及时间不同浓度的透骨血竭散含药血清干预RA-FLS细胞12 h，细胞活力均无明显影响（P>0.05），见图 1A。在干预24和48 h后，15%和20%的透骨血竭散含药血清能显著降低RA-FLS的细胞活力（P＜0.05）；但15%和20%的透骨血竭散含药血清对RA-FLS细胞活力的影响比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图 1B、1C。因此，这里选用15%的透骨血竭散含药血清干预24 h进行后续实验，可确保RA-FLS细胞活力下降。
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| 注：细胞实验独立重复3次。ns为P>0.05，*P＜0.05。 图 1 不同浓度及干预时间的透骨血竭散含药血清对RA-FLS细胞活力的影响 Fig. 1 Effect of Tugu Xuejie Decoction containing serum at different concentrations and intervention time on the viability of RA-FLS cells |
与A组相比，B组的细胞增殖能力显著升高（P＜0.05）；与B组相比，C组RA-FLS细胞增殖能力下降（P＜0.05）；且D组RA-FLS细胞增殖能力显著高于C组（P＜0.05）。表明透骨血竭散含药血清通过调控PI3K/AKT信号通路抑制RA-FLS细胞增殖。见图 2。
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| 注：细胞实验独立重复3次。A，对照组；B，模型组；C，LPS+15%透骨血竭散组；D，LPS+15%透骨血竭散+PI3K激活剂组。**P＜0.01，***P＜0.001。 图 2 各组RA-FLS细胞增殖能力比较 Fig. 2 Comparison of proliferation capacity of RA-FLS cells in each group |
与A组相比，B组的细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；与B组相比，C组RA-FLS细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；且D组RA-FLS细胞凋亡率低于C组（P＜0.05）。结果表明，透骨血竭散含药血清通过调控PI3K/AKT信号通路促进RA-FLS细胞凋亡。见图 3。
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| 注：细胞实验独立重复3次。A，对照组；B，模型组；C，LPS+15%透骨血竭散组；D，LPS+15%透骨血竭散+PI3K激活剂组。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。 图 3 各组RA-FLS细胞凋亡率比较 Fig. 3 Comparison of apoptosis rates of RA-FLS cells in each group |
与A组相比，B组的细胞迁移能力显著升高（P＜0.05）；与B组相比，C组RA-FLS细胞迁移能力降低（P＜0.05）；且D组RA-FLS细胞迁移能力较C组明显增强（P＜0.05）。结果表明，透骨血竭散含药血清通过调控PI3K/AKT信号通路抑制RA-FLS细胞迁移。见图 4。
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| 注：细胞实验独立重复3次。A，对照组；B，模型组；C，LPS+15%透骨血竭散组；D，LPS+15%透骨血竭散+PI3K激活剂组。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。 图 4 各组RA-FLS细胞迁移能力比较 Fig. 4 Comparison of migration abilities of RA-FLS cells in each group |
与A组相比，B组的细胞侵袭数显著增多（P＜0.05）；与B组相比，C组RA-FLS细胞侵袭数降低（P＜0.05）；且D组RA-FLS细胞侵袭数多于C组（P＜0.05）。结果表明，透骨血竭散含药血清通过调控PI3K/AKT信号通路抑制RA-FLS细胞侵袭。见图 5。
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| 注：细胞实验独立重复3次。A，对照组；B，模型组；C，LPS+15%透骨血竭散组；D，LPS+15%透骨血竭散+PI3K激活剂组。**P＜0.01，***P＜0.001。 图 5 各组RA-FLS细胞侵袭能力比较 Fig. 5 Comparison of invasion ability of RA-FLS cells in each group |
与A组相比，B组的IL-6、TNF-α及IL-1β水平显著升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；与B组相比，C组RA-FLS细胞IL-6、TNF-α及IL-1β水平降低，IL-10水平升高（P＜0.05）。且D组RA-FLS细胞IL-6、TNF-α及IL-1β水平高于C组，IL-10水平低于C组（P＜0.05）。结果表明，透骨血竭散含药血清通过调控PI3K/AKT信号通路缓解RA-FLS细胞炎症反应。见表 1。
| pg/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | IL-6 | TNF-α | IL-1β | IL-10 | |||||||||||||||||||||||||
| A组 | 95.12±10.21 | 28.63±5.58 | 112.54±7.53 | 45.18±5.16 | |||||||||||||||||||||||||
| B组 | 205.85±20.46* | 85.96±12.63* | 351.85±26.35* | 14.59±3.18* | |||||||||||||||||||||||||
| C组 | 126.95±18.59*# | 40.52±9.58*# | 226.37±25.74*# | 33.49±4.27*# | |||||||||||||||||||||||||
| D组 | 175.25±15.47*#△ | 67.44±8.55*#△ | 294.75±22.71*#△ | 20.55±3.97*#△ | |||||||||||||||||||||||||
| F | 26.35 | 22.69 | 65.88 | 31.66 | |||||||||||||||||||||||||
| P | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | |||||||||||||||||||||||||
| 注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05。A组，对照组；B组，模型组；C组，LPS+15%透骨血竭散组；D组，LPS+15%透骨血竭散+PI3K激活剂组。细胞实验独立重复3次。 | |||||||||||||||||||||||||||||
与A组相比，B组的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-GSK-3β/GSK-3β比值显著升高（P＜0.05）；与B组相比，C组RA-FLS细胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-GSK-3β/GSK-3β比值降低（P＜0.05）。且D组RA-FLS细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-GSK-3β/GSK-3β比值高于C组（P＜0.05）。结果表明，透骨血竭散含药血清可阻断PI3K/AKT信号通路激活，降低下游关键分子（如mTOR、GSK-3β等）磷酸化水平。见图 6。
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| 注：A组，对照组；B组，模型组；C组，LPS+15%透骨血竭散组；D组，LPS+15%透骨血竭散+PI3K激活剂组。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。 图 6 各组RA-FLS细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达比较 Fig. 6 Comparison of related protein expression in PI3K/AKT signal pathway of RA-FLS cells in each group |
RA作为一种慢性自身免疫性疾病，其核心病理特征为滑膜增生和炎症反应，FLS的异常增殖、迁移和侵袭是导致关节破坏和功能障碍的关键因素[11]。传统中医药在RA治疗中积累了丰富经验，透骨血竭散作为经典方剂，其含药血清在体外实验中展现出对RA-FLS生物学行为的调控作用，本研究聚焦于PI3K/AKT信号通路，旨在揭示其分子机制，为中药现代化提供科学依据。
PI3K/AKT信号通路是细胞内的核心信号传导网络，mTOR和GSK-3β均为PI3K/AKT信号通路的关键下游分子，AKT通过磷酸化调控两者的活性，进而影响细胞增殖、存活、迁移及代谢等关键生理过程[12]。现有证据表明，该通路过度激活会驱动RA-FLS呈现肿瘤样侵袭特性，引发滑膜炎症反应及骨软骨破坏[13]。因此，靶向抑制PI3K/AKT通路可能有效延缓疾病进展。本研究发现透骨血竭散能够降低p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-GSK-3β/GSK-3β比值，提示透骨血竭散含药血清可阻断PI3K/AKT信号通路激活，降低下游关键分子（如mTOR、GSK-3β等）磷酸化水平，从而抑制RA-FLS细胞的迁移和侵袭。
透骨血竭散是中医治疗RA及骨关节疾病的经典方剂，其组成以透骨草、血竭为核心，辅以当归、红花、艾叶、桂枝、白芍、青风藤、补骨脂、白芥子、土鳖虫等药材，通过祛风除湿、活血化瘀、温经通络、补益肝肾等多途径发挥作用[14]。研究通过LPS刺激RA-FLS，模拟接近体内的炎性刺激环境，发现RA-FLS细胞增殖能力提升，细胞凋亡率显著降低。经透骨血竭散含药血清处理24 h后，RA-FLS细胞增殖能力下降，细胞凋亡率升高。分析原因在于透骨血竭散核心成分（如血竭、透骨草）可能通过抑制PI3K/AKT通路关键分子（如PI3K、AKT磷酸化），阻断其下游mTOR、GSK3β等信号传导，从而抑制细胞增殖并诱导凋亡[15]。血竭中的成分可上调促凋亡蛋白（Bax、Caspase-3）表达，下调抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达，触发线粒体膜电位下降及细胞色素c释放，最终激活Caspase-3等凋亡执行分子[16-17]。
研究进一步通过划痕实验及Transwell检测细胞迁移、侵袭能力，结果发现LPS刺激的RA-FLS细胞迁移、侵袭数明显升高。经透骨血竭散含药血清处理24 h后，RA-FLS细胞迁移、侵袭能力下降。分析原因在于，PI3K/AKT通路通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）及核因子κB（NF-κB），上调基质金属蛋白酶（MMPs）表达，促进细胞外基质（ECM）降解以增强侵袭能力[18]。透骨血竭散可能通过阻断PI3K/AKT信号通路激活，降低下游关键分子（如mTOR、GSK-3β等）磷酸化水平，进而抑制MMPs转录，减少ECM破坏，直接限制RA-FLS的侵袭潜能。且PI3K/AKT通路激活可诱导上皮-间质转化（EMT），通过上调蜗牛蛋白（Snail）、扭曲相关蛋白（Twist）及N-钙黏蛋白等转录因子，赋予细胞迁移特性[19-20]。透骨血竭散可能通过抑制该通路，维持E-钙黏蛋白表达并下调间质标志物，从而逆转EMT表型，降低RA-FLS的迁移能力[21-22]。前期研究显示透骨血竭散可诱导RA-FLS凋亡，而凋亡细胞可能通过释放凋亡小体或信号分子（如TGF-β）调控邻近细胞行为[23]。凋亡与侵袭的平衡破坏可能进一步限制RA-FLS的整体侵袭能力。
此外，研究发现，LPS刺激的RA-FLS细胞上清液中促炎因子水平明显升高，经透骨血竭散含药血清处理24 h后，RA-FLS细胞上清液中促炎因子水平降低。提示透骨血竭散可能缓解炎症反应、改善炎症微环境。分析原因在于：透骨血竭散中的当归、红花等成分具有抗炎作用，可能减少促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）分泌，促进抗炎因子IL-10释放。且以往动物实验证实，透骨血竭散可显著降低RA大鼠模型中TNF-α、IL-1β等炎性因子水平，减轻关节肿胀及炎性反应[24]。
为了进一步论证PI3K/AKT信号通路是透骨血竭散含药血清干预RA的关键，研究使用PI3K激动剂740Y-P联合透骨血竭散含药血清干预RA-FLS细胞24 h。发现经PI3K激活剂处理后，部分逆转了透骨血竭散含药血清对RA-FLS细胞增殖、迁移、侵袭能力的抑制作用，及对RA-FLS细胞炎症反应的改善作用。提示透骨血竭散含药血清通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制RA-FLS细胞的恶性行为，从而缓解RA。这与RA临床治疗中旨在控制滑膜炎、阻止关节破坏的目标高度一致。实验中观察到的细胞增殖抑制，直接对应着临床上的滑膜组织增生减轻。这预示着透骨血竭散可能有助于缩小增生的滑膜体积，缓解关节肿胀和疼痛。RA-FLS的迁移和侵袭能力是其破坏软骨和骨的关键。本研究的抑制效应表明，透骨血竭散可能从源头上减少了“攻击性”细胞向软骨下骨的侵入，从而有望延缓或阻止关节的影像学进展，保护关节功能。透骨血竭散由血竭、透骨草等经典活血化瘀、通络止痛的中药组成，在中医理论中广泛应用于“痹证”的治疗，具有悠久的临床实践基础。本研究采用含药血清进行实验，其结果比直接使用药材提取物更能反映药物经体内代谢后的真实生物活性，极大地增强了其结果向临床转化的说服力。与现有RA治疗药物相比，透骨血竭散可能展现出独特的优势和定位。甲氨蝶呤是RA治疗的基石，但起效较慢，且有肝毒性、骨髓抑制等不良反应。透骨血竭散可能作为辅助治疗，与甲氨蝶呤联用，以期实现协同增效、减毒，或用于对甲氨蝶呤不耐受的患者。透骨血竭散展现出良好的临床转化前景，后续通过严格设计的临床试验，有望开发出一种源于中药、作用机制明确、安全有效的RA治疗新策略，丰富RA的临床治疗方法。
综上所述，透骨血竭散含药血清通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制RA-FLS细胞的恶性行为，为RA临床治疗提供了理论支撑。然而，研究也存在一些不足之处。本研究的主要目的是首先在细胞水平上，明确透骨血竭散抗炎和调控相关信号通路（PI3K/AKT）等的初步作用靶点和机制，从而为后续更复杂的体内实验提供坚实的理论依据和明确的观察指标。但本研究缺乏动物体内实验的验证，细胞模型无法完全模拟人体内复杂的免疫微环境和药物代谢动力学过程。因此，在未来的研究中，建立CIA（胶原诱导性关节炎）或AA（佐剂性关节炎）小鼠模型，在整体动物水平上进一步评估透骨血竭散对关节肿胀、骨侵蚀及系统性炎症的改善作用，并验证其对本文所发现的信号通路的调控作用，从而为透骨血竭散的临床转化提供更充分、更可靠的临床前数据。且由于本研究技术未完善，后续需重点关注透骨血竭散有效成分的定性定量分析及含药血清中活性成分的检测，以便深层次探究其治疗RA的作用机制。此外，未来研究需进一步探索通路与其他信号网络的交互作用，并开展多中心临床试验，验证靶向PI3K/AKT治疗RA的疗效及安全性。
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