卒中后抑郁（PSD）是卒中后最常见的神经精神障碍，患病率高达30%以上^[1]。其中重度抑郁可伴有严重的自杀倾向甚至自杀行为^[2]。PSD显著地增加患者的致残率和病死率，特别是认知功能受损较大，致使患者的整体生活质量降低明显，给家庭造成沉重负担^[3]。该病属于中医学郁证中“因病致郁”的范畴^[4]。患者平素气血亏虚，导致心、肝、肾三脏阴阳失调，加之忧思恼怒或外邪侵袭等诱因，造成机体阳亢于上，阴亏于下，上扰脑神，而窍闭神匿^[5]。该病以“窍闭神匿、神不导气”为根本病机。确立以醒脑开窍治疗方法来治疗中风病及其导致的一系列后遗症，创立醒脑开窍针刺法^[6]。醒脑开窍针刺法符合卒中以及其并发精神心理疾病的根本病机，精选穴位，切中要害^[7]。针刺可以显著提高脑血流速度，改善脑组织的灌注状态，尤其是在卒中后，这种效果尤为明显。针刺通过激活交感神经系统和扩张血管，促进血液流动，可以降低缺血性损伤^[8]。此外，针刺还可以通过调节内源性神经递质的释放，进一步增强脑血流的调节能力。故本文探讨醒脑开窍针刺对PSD大鼠行为学改变及单胺类神经递质释放的影响，为PSD的临床治疗提供参考。

1 材料和方法 1.1 实验动物

选用52只健康成年SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g；购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2018-0026，分笼饲养于湿度50%~70%，室温20~25 ℃的适宜环境中，自由摄食饮水，自然昼夜节律光照。动物实验通过本院伦理委员会审核，批件号：2021-089-001。

1.2 主要试剂和仪器

氟西汀购自上海吉至生化科技有限公司；5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购买于上海碧云天生物技术有限公司；冷冻式离心机购自德国Eppendorf公司，-80 ℃超低温冰箱购自日本三洋公司。

1.3 实验方法 1.3.1 动物建模

将56只SD大鼠随机分为正常组、模型组、药物组、针刺组，每组14只。除正常组外，其余42只大鼠均采用Longa线栓法和慢性不可预知性温和应激（CUMS）法复合制备PSD模型。首先釆用大脑中动脉栓塞法（MCAO）模型以建立脑卒中模型^[9]。将大鼠麻醉后，分离右侧颈内动脉、颈外动脉、颈总动脉，将颈外动脉和颈总动脉近心端结扎，用动脉夹暂时夹闭颈内动脉。在颈总动脉距离颈外动脉和颈内动脉分叉处约1 cm剪出“V”字切口，将0.2 mm直径线栓缓慢插入颈内动脉后固定，深度大约为1.7 cm即可，1 h后拔出线栓，结扎颈内动脉，缝合切口，术后7 d后按Longa评分法进行神经功能评分，Longa评分2~3分为造模成功。

第7天起，采用孤养法+CUMS法制备卒中后大鼠抑郁模型。CUMS刺激方法如下：将鼠笼倾斜45°处理，共计24 h。模拟白昼颠倒，各12 h；将大鼠束缚于管径为50 mm的PPR管中，管口处用木板挡住，持续1 h；将大鼠放于水温4 ℃左右，水面高度为30 cm容器内，游泳时间为5 min；再用木屑、水配成潮湿垫料置于笼中，持续24 h，然后禁水禁食24 h后，用夹子将鼠尾距根部2 cm处夹住，持续5 min CUMS连续刺激第21天，如果大鼠出现精神不振，常蜷缩少动及毛色晦暗等状态，表明大鼠处于抑郁状态，提示模型建模成功。本研究拟定大鼠神经功能评分为2~3分，且糖水消耗实验糖水消耗下降超过30%和强迫游泳实验中不动时间显著增加，即为稳定的PSD大鼠模型。其中模型组建模失败和死亡共3只、药物组建模失败1只，针刺组建模失败2只，剔除建模过程中建模失败和死亡的大鼠6只，建模型成功率为85.71%，除正常组外，最终纳入36只大鼠。

1.3.2 干预方法

药物组予氟西汀灌胃治疗，CUMS刺激21 d后给药，给予氟西汀2.31 mg/kg^[10]，每日1次，连续给药35 d。针刺组利用醒脑开窍针刺法^[11]进行针刺处理，根据大鼠穴位图谱进行大鼠穴位定位，首选“内关”“水沟”“三阴交”“百会”穴位，以0.25 mm×25 mm的毫针，水沟穴向上斜刺2~3 mm轻雀啄法，内关直刺5~8 mm泻法，三阴交直刺2~3 mm补法；百会向前斜刺2 mm轻捻转平补平泻；水沟、内关不留针；余穴留针30 min，每日1次，连续治疗35 d。正常组和模型组给与生理盐水1 mL灌胃，连续35 d。所有操作者经过统一培训，且行为学评估者盲于实验分组。

1.3.3 神经功能缺损评分

分别于实验造模前（0 d）、CUMS前（7 d）、治疗前（14 d）、治疗后（35 d）进行Longa神经功能缺损评分，无任何神经功能损伤症状为0分；提拎尾部使大鼠身体离开地面，前爪不完全伸展为1分；大鼠行走时，左前肢肌力减弱为2分；大鼠行走时，左前肢肌力减弱加重无法行走为3分；大鼠意识丧失或昏迷，不能自己苏醒为4分。

1.3.4 体质量测量

分别于实验造模前（0 d）、CUMS前（7 d）、治疗前（14 d）、治疗后（35 d）记录大鼠体质量。动物称质量前禁食、禁水。

1.3.5 旷场实验

分别于实验造模前（0 d）、CUMS前（7 d）、治疗前（14 d）、治疗后（35 d）进行旷场实验，100 cm×100 cm×50 cm木箱，底面和四周均为黑色，无盖，底面划分为16个25 cm×25 cm的小方格。实验室温度在22~24 ℃，湿度在40%~60%，使用均匀的白光照明模拟自然环境，亮度应保持在100~300 Lux的范围内，大鼠置于敞箱中心，观察3 min内活动情况，以穿越地面方块数作为水平运动得分，后肢直立次数作为垂直运动得分。

1.3.6 糖水偏好实验

分别于实验造模前（0 d）、CUMS前（7 d）、治疗前（14 d）、治疗后（35 d）进行糖水偏好实验，安静的环境中进行实验，使用均匀的白光照明，温度在22~24 ℃，湿度在40%~60%，避免噪音和干扰。第1天给予大鼠1%蔗糖水2瓶，第2天给予大鼠1%蔗糖水及蒸馏水各1瓶，第3天禁食、禁水24 h，然后再给予各组大鼠1%蔗糖水及蒸馏水各1瓶，计算大鼠饮用蔗糖水和喝蒸馏水的质量，计算糖水消耗量，糖水消耗量=糖水饮用量/（蔗糖水饮用量+蒸馏水饮用量）×100%。通常测试时间为24 h。

1.3.7 血清中单胺类神经递质释放检测

4组大鼠进行完上述实验后，分别以1%戊巴比妥钠4 mL/kg腹腔注射麻醉，取腹主动脉血5 mL，静置2 h，进行离心处理，4 ℃、3 000 r/min，离心半径10 cm，离心15 min，分层后留取上层血清-80 ℃冰箱保存。ELISA试剂盒检测大鼠血清5-HT、DA、NE含量，按照试剂盒的使用说明进行操作，7 ℃避光温育10 min后，加入终止液终止反应，10 min内在450 nm处测量各孔光密度值，绘制标准曲线，查出5-HT、DA、NE浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS25.0软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差One-way ANOVA分析，多个时间点连续观察指标组间采用重复测量数据资料的方差分析，并使用Bonferroni法进行事后检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 大鼠的一般情况观察

正常组大鼠饮食活动量较好，精神状态正常；除正常组外，各组在治疗前14 d时，精神状态萎靡不振，进水饮食量和活动量减少，体型较正常组大鼠偏小。第35天时，模型组大鼠一般情况如前，无明显变化，而药物组和针刺组精神状态恢复良好，进水饮食和活动量开始增加，实验中共计死亡大鼠4只，模型组2只，药物组1只，针刺组1只，死亡主要原因是肠梗阻和肺部感染。

2.2 醒脑开窍针刺对大鼠的神经功能缺损评分的影响

时间和组别对大鼠的神经功能缺损评分影响的交互效应显著（F=257.900，P < 0.001），并且时间主效应（F=1 958.00，P < 0.001）与组别主效应均显著（F=1 623.00，P < 0.001）。进一步进行单独效应分析，CUMS前和治疗前（14 d），模型组、药物组和针刺组神经功能缺损评分高于正常组（P < 0.001）；治疗后（35 d），药物组和针刺组神经功能缺损评分明显低于模型组，而针刺组和药物组神经功能缺损评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。

2.3 醒脑开窍针刺对大鼠体质量的影响

时间和组别对大鼠的体质量影响的交互效应显著（F=23.360，P < 0.001），并且时间主效应（F=1 882.00，P < 0.001）与组别主效（F=170.10，P < 0.001）应均显著。进一步进行单独效应分析，造模前（0 d），4组比较差异无统计学意义（P>0.05）。CUMS前，模型组、药物组和针刺组的体质量低于正常组（P < 0.001），但模型组、药物组和针刺组的体质量比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗前（14 d），模型组、药物组和针刺组的体质量低于正常组（P < 0.001），其余各组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后（35 d），药物组和针刺组的体质量显著高于模型组（P < 0.001），而针刺组和药物组的体质量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。

2.4 醒脑开窍针刺对大鼠旷场实验结果的影响

时间和组别对大鼠旷场实验垂直得分、旷场实验水平得分影响的交互效应显著（F=7.190、23.610，P < 0.001），并且时间主效应（F=38.660、83.900，P < 0.001）与组别主效应（F=24.510、84.330，P < 0.001）均显著。进一步进行单独效应分析，造模前（0 d），4组的旷场实验垂直得分和水平得分比较差异无统计学意义（P>0.05）。CUMS前和治疗前（14 d），模型组、药物组和针刺组的旷场实验垂直得分和水平得分低于正常组（P < 0.001），但模型组、药物组和针刺组的旷场实验垂直得分和水平得分比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后（35 d），药物组和针刺组的垂直得分和水平得分明显高于模型组（P < 0.001），但是药物组和针刺组的垂直得分和水平得分比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3和表 4。

2.5 醒脑开窍针刺对各组大鼠糖水消耗量的影响

时间和组别对大鼠糖水消耗量结果影响的交互效应显著（F=2.076，P=0.034），并且时间主效应（F=5.073，P=0.002）与组别主效（F=9.085，P < 0.001）应均显著。进一步进行单独效应分析，造模前（0 d），4组比较差异无统计学意义（P>0.05），CUMS前和治疗前（14 d），模型组、药物组和针刺组的糖水消耗量低于正常组（P < 0.001），但模型组、药物组和针刺组的糖水消耗量比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后（35 d），药物组和针刺组的糖水消耗量明显高于模型组（P < 0.001），但针刺组和药物组的糖水消耗量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 5。

2.6 醒脑开窍针刺对大鼠单胺类神经递质释放的影响

治疗前（14 d），与正常组相比，模型组、药物组、针刺组的5-HT、DA和NE水平均明显降低（P < 0.05），治疗后（35 d），与治疗前（14 d）相比，药物组、针刺组的5-HT、DA和NE水平均明显降低（P < 0.05），与正常组相比，模型组中5-HT、DA和NE水平显著降低（P < 0.05），与模型组相比，药物组和针刺组中5-HT、DA和NE水平明显升高（P < 0.05），而且药物组和针刺组中5-HT、DA和NE水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 6。

2.7 行为学指标与神经递质水平的相关性

Person相关性分析结果显示，旷场实验得分、糖水消耗量与5-HT、DA和NE水平均呈正相关（P < 0.05）。见表 7。

3 讨论

PSD是脑卒中继发的心理和躯体障碍疾病，大约有30%患者可能在卒中后的不同时期发病，严重影响患者的情绪、思维和活动^[11]。同时加重神经和认知功能损伤，加重卒中患者的自理生活能力，自卑的情绪易诱发自残率和增加病死率，给家庭及社会带来较大影响^[12]。PSD与许多因素相关，其发病机制相对复杂。目前研究认为，该病的发病是建立在脑卒中基础上，多因素介导的神经递质变化、炎性因子机制、神经网络功能障碍机制共同参与的结果^[13]。从中医学角度来看，PSD症既有郁证“情志不舒、气机不畅”的特点，又有卒中的“神不导气、窍闭神匿、气滞血瘀”的特点^[14]。相关学者研究表明，针刺能够通过调节神经系统、内分泌系统和免疫系统的功能，促进血液循环，改善局部血流，增强氧供给，减轻炎症反应等生理过程^[15]。另外，针刺还可以激活大脑的特定区域，促进神经生长因子的释放，进而促进神经细胞的存活和再生^[16]。但传统的针刺不太依赖其他辅助技术，通常选择多个穴位，并涉及全身的脏腑和经络，常用的穴位有神阙、足三里、合谷等，通过调节气血、平衡阴阳，最终达到治疗疾病的效果。而醒脑开窍针可以结合温针、电针等技术，主要选择神门、百会和风池等大脑意识和功能相关的穴位，通过改善神经功能和脑部血液循环达到治疗疾病的目的。因此，本研究采用醒脑开窍针刺法干预大鼠PSD行为和大鼠血清单胺类神经递质释放，为PSD的治疗提供一种经济、有效、安全的方法。

本研究通过建立大鼠PSD模型，采用醒脑开窍针刺考察其对大鼠PSD行为学改变以及单胺类神经递质释放的影响。结果显示，除正常组神经功能缺损评分对比差异无统计学意义，其余各组的神经功能缺损评分从CUMS前到治疗前，均呈现上升趋势，但治疗后第35天，针刺组和药物组的神经功能缺损评分明显低于模型组。表明醒脑开窍针刺能够明显改善PSD大鼠行为学的变化，减轻神经功能损伤，可以代替药物进行治疗。相关研究表明，针刺联合乌灵胶囊对其神经损伤也有一定的修复作用，且安全性较高，与本研究结果类似^[17]。文中体质量研究结果显示，除正常组在整个实验过程中对比差异无统计学意义，其余各组从CUMS前到治疗前，体质量均呈下降趋势，治疗后第35天，针刺组和药物组的体质量明显高于模型组。表明醒脑开窍针刺能够明显改善PSD大鼠的体质量，缓解CUMS刺激下对体质量增幅减小的情况。体质量变化是应激引起抑郁症状的重要衡量指标之一，相关研究表明，针刺干预后的PSD大鼠体质量增长幅度明显高于未干预的PSD大鼠^[18]，与本研究验证结果类似。

旷场实验能够通过观察大鼠在陌生环境中的一系列行为来判断其探索性和焦虑程度^[19]。在旷场实验中模型组大鼠由于更易陷入绝望的状态，经常会出现呆立不动的情况，反映在相关行为学数据上，则垂直得分和水平得分较低。本研究旷场实验研究结果表明，造模前，各组大鼠的旷场实验垂直得分和水平得分对比无明显差异，正常组的旷场实验垂直得分和水平得分组不同时间对比无明显差异。CUMS前和治疗前，药物组和针刺组垂直得分和水平得分逐渐降低，治疗后，药物组和针刺组的垂直得分和水平得分明显优于模型组。表明醒脑开窍针刺能够明显改善大鼠的行为学能力。相关研究表明，联合针刺组大鼠水平跨格数和直立次数均明显高于模型组^[20]，与本研究结果类似。本研究大鼠糖水消耗量实验结果表明，造模前，各组大鼠的糖水消耗量对比差异无统计学意义，正常组的糖水消耗量不同时间对比差异无统计学意义。CUMS前和治疗前，药物组和针刺组糖水消耗量逐渐降低，治疗后，药物组和针刺组的糖水消耗量明显高于模型组。糖水消耗量反映动物的偏好反应程度，相关研究表明，针刺组糖水消耗量明显高于模型组^[21]，与本研究结果一致。

5-HT、NE、DA等神经递质参与人类相关行为的调节，它们与人类精神活动尤其是情感活动密切相关^[22]。5-HT能够影响认知、情绪和脑发育；5-HT和NE神经传导及其传导通路受到影响，导致大脑情绪调节功能障碍，从而产生PSD障碍。DA与奖励、动机、运动控制和情绪调节等功能相关，DA的失衡与抑郁症、精神分裂症等多种精神疾病有关；NE主要参与应激反应、注意力和警觉性等功能。NE的水平变化与焦虑、抑郁及其他情绪障碍相关。研究表明，PSD患者血浆和脑脊液中NE，5-HT以及5-HT的代谢产物，DA以及DA代谢产物含量明显下降^[23]。本研究通过ELISA法检测大鼠血清中5-HT、DA和NE水平，治疗后，与正常组相比，模型组中5-HT、DA和NE水平显著降低，与模型组相比，药物组和针刺组中5-HT、DA和NE水平明显升高。表明醒脑开窍针刺能够明显改善PSD大鼠的神经递质释放水平。另外，血清中的5-HT、DA和NE水平与脑组织中的相应递质水平存在一定的正相关关系，血清5-HT水平的升高可能反映脑组织中5-HT水平的增加^[24-25]。但是血清和脑组织中神经递质的水平并不总是完全一致，可能受到血脑屏障、代谢和转运、生理状态有关。血脑屏障的存在使得血液中的神经递质不一定能直接反映脑组织中的水平；神经递质在体内的合成、代谢和转运过程可能导致血清和脑组织中的浓度差异；另外应激、药物治疗、疾病状态等都可能影响血清和脑组织中递质的水平。血清5-HT、DA和NE水平与脑组织中相应递质的相关性是一个复杂的研究领域，需要综合考虑多种因素来理解其机制和临床意义。

综上所述，醒脑开窍针刺在改善行为学和神经递质方面与氟西汀效果相当，对神经功能损伤具有一定的恢复作用，值得后续临床中的进一步应用。但本研究存在一定局限性，仅观察大鼠的行为学和神经递质的变化，对其具体机制的理解仍然有限，缺乏深入分子机制研究和相关信号通路的探讨，后续会开展相应的临床研究，为临床治疗和应用提供理论基础。