原发性肝癌是临床上最常见的以及最具侵袭性的恶性肿瘤之一^[1]。肝癌恶性程度高，术后易复发、易转移。肝癌细胞的迁移及侵袭是导致肝癌转移的重要因素。上皮间质转化（EMT）是上皮肿瘤细胞失去上皮特征并获得间质表型的过程，被认为是导致上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的重要生物学过程^[2]。有研究表明CD44和ERK是促进细胞EMT的重要分子^[3-4]。

近年来，中医药在肿瘤疾病尤其是中晚期癌症中的应用越来越广泛，大量临床研究表明，中药复方联合西医治疗手段可提高临床疗效，健脾化瘀方为其中之一。本课题组前期通过体内外实验研究发现健脾化瘀方可以抑制肝癌细胞的EMT，进而抑制其迁移及侵袭^[5]。本研究基于CD44/ERK信号通路，探讨健脾化瘀方是否能通过调节CD44/ERK信号通路抑制肝癌细胞EMT的发生从而影响肝癌细胞迁移及侵袭能力。

1 材料与试剂 1.1 细胞及动物

肝癌细胞株MHCC-97H购自中国科学院上海细胞库。SPF级8周龄SD雄性大鼠20只（购置于广州中医药大学动物实验中心）。

1.2 健脾化瘀方水煎剂

健脾化瘀方：人参20 g，白术15g，山药12 g，茯苓15g，牡丹皮10g，丹参15 g，郁金10 g，莪术10 g，柴胡15 g，甘草6 g，共128 g。由广州中医药大学一附院中药房统一提供，按水煎剂制备，最终浓缩成1.0g/mL水煎剂（按生药量计算），保存备用。

1.3 健脾化瘀方含药血清的制备

将SD雄性大鼠随机分为2组（10只/组），健脾化瘀方组给药剂量为20g/（kg·d），相当于临床等效量，对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。连续给药1周，第8天早灌胃1次后于2 h后麻醉下腹主动脉取血。然后参考沈俊岭等^[6]的方法对动脉血进行处理，得到对照组血清及健脾化瘀方含药血清。各浓度含药血清配置方法如下：20%含药血清：DMEM培养基与含药血清按体积8∶2混合。10%含药血清：DMEM培养基、含药血清和对照组血清按体积8∶1∶1混合。0%含药血清：DMEM培养基与对照组血清按体积8∶2混合。本研究获得了广州中医药大学伦理委员会批准（20250704032）。

1.4 主要试剂

BCA法蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物发展有限公司）；可下调分化群44（CD44）、细胞外信号调节激酶（ERK）、锌指蛋白转录因子（Snail）、波形蛋白（Vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、E-钙黏着蛋白（E-cadherin）鼠抗人单克隆抗体一抗（Abcam公司）；逆转录试剂盒，荧光法qRT-PCR试剂盒（广州锐博生物公司）。

1.5 主要仪器

细胞培养箱（Nuair，美国）；全波长酶标仪（Biotek，美国）；电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；梯度PCR仪、荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96，美国）。

2 方法 2.1 划痕实验

6孔板内接种MHCC97H细胞（25×10⁵个/孔），待细胞铺满后做划痕，分别用0%、10%、20%含药血清继续培养48 h。于0、24、48 h在显微镜下拍照记录。用Image J软件测量划痕宽度，计算迁移率。

2.2 Transwell实验

参考文献[7]方法，于铺有Matrigel胶的24孔板上室中接种MHCC97H细胞（5×10⁴个/孔），分别用0%含药血清、10%含药血清、20%含药血清进行干预。24 h后取出小室并擦去上室细胞，甲醇固定后0.1%结晶紫染色，显微镜下拍照记录，Image J统计侵袭细胞数。

2.3 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）实验

收集经过不同干预的3组MHCC97H细胞，提取各组细胞总RNA。使用逆转录试剂盒及荧光法qRT-PCR试剂盒进行逆转录及Real-time PCR检测。以β-actin为内参，根据各个基因的Ct值，计算其在不同组别的相对表达水平。引物由苏州泓迅生物技术股份有限公司合成，引物序列见表 1。

2.4 蛋白免疫印记法（Western Blot）实验

收集经过不同干预的3组MHCC97H细胞，裂解后提取蛋白，以BCA法测定蛋白质定量，等量蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，并孵育anti-CD44、anti-ERK、anti-Snail，anti-E-cadherin，anti-N-cadherin，anti-Vimentin，anti-β-actin一抗及羊抗兔二抗。用化学发光ECL检测试剂盒（Thermo Fisher）进行免疫印迹。

2.5 统计学方法

实验结果采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间采用单因素方差分析，组间两两比较用Tukey检验；α=0.05作为检验水准，P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 健脾化瘀方含药血清可抑制MHCC97H细胞的迁移、侵袭

细胞划痕及Transwell实验结果显示，与对照组相比，10%和20%含药血清组的MHCC97H细胞迁移能力减弱（24 h、48 h，P < 0.001）见图 1；侵袭能力减弱（P < 0.001），见图 2。与10%含药血清组相比，20%含药血清组的MHCC97H细胞迁移能力减弱（24 h P < 0.01，48 h P < 0.001）见图 1；侵袭能力减弱（P < 0.001），见图 2。结果证明，健脾化瘀方含药血清可抑制MHCC97H细胞的迁移、侵袭。

3.2 健脾化瘀方含药血清对CD44、ERK、Snail、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin基因表达水平的影响

q RT-PCR结果显示，与对照组相比，10%和20%含药血清组的MHCC97H细胞CD44表达下降（P < 0.01），ERK表达下降（P < 0.001），Snail表达下降（P < 0.001），Vimentin表达下降（P < 0.01），N-cadherin表达下降（P < 0.001），E-cadherin表达升高（P < 0.001）。此外，与10%含药血清组相比，20%含药血清组的MHCC97H细胞，N-cadherin表达下降（P < 0.001），E-cadherin表达升高（P < 0.01）。结果表明，健脾化瘀方含药血清可以使CD44、ERK、Snail、Vimentin、N-cadherin的基因表达水平下调，E-cadherin的基因表达水平上调。见图 3。

3.3 健脾化瘀方含药血清对ERK、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达水平的影响

Western Blot结果显示，与对照组相比，20%含药血清组MHCC97H细胞中ERK、Vimentin、N-cadherin的蛋白表达水平显著降低（P < 0.001或P < 0.0001），而E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P < 0.01）。与20%含药血清组相比，ERK激动剂联合20%含药血清组MHCC97H细胞中ERK、Vimentin、N-cadherin的蛋白表达水平显著回升（P < 0.05或P < 0.01），E-cadherin蛋白表达水平显著下降（P < 0.05）。结果表明，健脾化瘀方含药血清可下调ERK、Vimentin、N-cadherin的蛋白表达水平，并上调E-cadherin的蛋白表达水平，而ERK激动剂可部分逆转这一调控作用。见图 4。

4 讨论

原发性肝癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，据全球癌症机构的统计数据，2022年全球原发性肝癌新发病例数高达86万，是全球第六大常见肿瘤，其病死率位居常见恶性肿瘤的第3位^[8]。尽管新型的靶向及免疫药物可以有效地提高肝癌患者的整体生存率，但多数肝癌患者在首次确诊时已经处于中晚期，且疾病进展迅速，极易发生肝内及远处转移。因此，深入研究肝癌的发病及转移机制，寻找其有效的治疗靶点至关重要。而传统中医药在肝癌的治疗前景方面备受瞩目。在中医上，笔者将肝癌归属为“积聚”范畴。病位主要在于肝脾，主要病机为脾虚气滞，瘀血内结。有研究对原发性肝癌的证候分布特征进行分析，在其发展过程中，“脾虚”这一病机贯穿始终。而在其证型上，“肝郁脾虚证”占比可达20%^[9]。因此，大量研究表明，以健脾为主要治疗原则是治疗肝癌的核心思路^[10]。健脾化瘀方是笔者团队临床常用方剂，其具有健脾益气，活血化瘀的功效。既往的临床研究证明，健脾化瘀方在联合手术治疗时，可显著延长肝癌患者的生存时间（OS）与无复发生存期（RFS）^[11]，同时其安全性能够得到保证。方中人参为君药以大补脾气，山药、白术、茯苓3味药共奏健脾渗湿之功，现代药理学研究表明茯苓中的“茯苓酸”能抑制人肝癌细胞的增殖分化并诱导其凋亡^[12]、人参中的人参皂苷能抑制肝癌细胞增殖、迁徙和侵袭，同时增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性^[13]。牡丹皮、丹参、郁金、莪术用以活血、止痛、化瘀均为佐药，亦有研究证实莪术中的“莪术油”通过作用于肝癌G2细胞来抑制肝癌细胞的增殖^[14]；柴胡引诸药入肝经，甘草调和诸药，为使药。本研究通过实验证明，健脾化瘀方含药血清可抑制MHCC97H细胞的迁移、侵袭，提示健脾化瘀方具有一定的抗癌作用，与前述临床研究结果一致。

EMT是将上皮细胞转化为间充质状态的过程，是促进肝癌发生发展的重要环节^[15]。肝癌细胞发生EMT时，肿瘤细胞失去细胞黏附，同时伴有角蛋白和E-cadherin等细胞标志物的下调，纤连蛋白与N-cadherin的表达上升。这些改变导致细胞获得成纤维细胞样的侵袭性表型，并抑制细胞凋亡。同时，ERK作为MAPK通路的关键分子，其激活可促进N-cadherin、Vimentin等细胞标志物的表达，同时抑制E-cadherin等细胞标志物的表达，从而促进肝癌细胞发生EMT^[16]。结果显示，健脾化瘀方含药血清组可显著下调ERK、Vimentin、N-cadherin的基因及蛋白表达水平，上调E-cadherin基因及蛋白表达水平，提示健脾化瘀方含药血清可抑制肝癌细胞发生EMT。

EMT是由多条复杂通路调节的过程，其中CD44/ERK通路在肿瘤细胞发生EMT时具有重要意义。研究发现，EMT可以诱导肿瘤细胞进入肿瘤干细胞（CSC）状态，同时间充质细胞将大量表达CD44^[17]。此外也有研究表明ERK信号通路通过MSK1/Elk-1介导的表观遗传调控Snail的表达，从而促进EMT。并且，CD44可以通过抑制ERK/Snail通路诱导EMT^[18]。实验表明，健脾化瘀方含药血清组可明显下调CD44、ERK的基因及蛋白表达水平，提示健脾化瘀方能通过抑制肝癌细胞的EMT进而抑制其迁移侵袭能力，可能与CD44/ERK通路的激活有关。

综上所述。健脾化瘀方能通过抑制肝癌细胞发生EMT以抑制其迁移侵袭能力，这可能与CD44/ERK通路的激活有关。本研究为阐述健脾化瘀方通过CD44/ERK信号通路抑制肝癌细胞EMT提供实验基础，为临床治疗肝癌提供新的方向。但此研究仍存在一定的局限性。首先，本研究需进一步完善体内实验，为健脾化瘀方的抗癌作用提供更有力的数据支持。其次，在探索CD44/ERK通路上仅仅观察到健脾化瘀方干预后，通路蛋白具有一定的表达差异，但具体的作用机制尚未明确，未来将进一步深入探索其可能的作用靶点。