肺癌在中国发病率和病死率仍呈现上升趋势^[1]。根据病理分型，肺癌主要分为非小细胞肺癌（NSCLC）与小细胞肺癌，其中，NSCLC约占肺癌病例的85%，肺腺癌占比约50%^[2]，目前肺腺癌的治疗涵盖手术、放射疗法、化学治疗、免疫检查点抑制剂治疗及靶向治疗等多种手段。其中，以免疫治疗和靶向治疗为代表的精准医学技术突破，显著提升了患者的长期生存获益和预后质量^[3]。然而，治疗过程中出现的耐药性及治疗相关并发症严重限制了其疗效，导致肺腺癌患者的整体预后改善有限^[4]。因此，探索更有效的肺腺癌治疗策略具有重要临床意义。

近年来，中医药凭借其多靶点调节的优势，在肿瘤防治领域，展现出价值与潜力。研究表明，中药在抑制肿瘤细胞增殖、减轻放化疗等治疗的不良反应、提高患者的生存期方面展现出潜在疗效^[5-6]。本研究团队基于中医“相火理论”，针对临床表现为“上热下寒、阴阳俱损”证候的患者，采用经典方剂引火汤进行治疗，显示出良好的治疗效果^[7]。然而引火汤抗肺腺癌的药效物质基础及作用机制尚未完全阐明，本研究拟采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术，对其给药后的入血成分进行分析。同时本研究将整合网络药理学方法预测其潜在作用机制，并通过细胞实验进行验证，系统解析引火汤的药效物质基础，并揭示引火汤治疗肺腺癌潜在的作用机制。

1 材料 1.1 细胞

人肺腺癌A549、H1299细胞株（购于武汉塞维尔生物科技有限公司）。

1.2 实验动物

选用8周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只，平均体质量（200±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（京）2024-0001]，实验动物购回后饲养于北中医东方医院SPF动物房，实验经东方医院伦理委员会批准，伦理号：DFYY2025021401R。

1.3 实验药物

引火汤中药颗粒制剂由熟地黄90 g、巴戟天30 g、麦冬15 g、茯苓30 g、五味子6 g组成，药物购自北京中医药大学东方医院中药房。大鼠灌胃给药剂量按成人与大鼠等效剂量换算，为人体临床剂量的6.3倍。引火汤中药配方颗粒临床用112 g/d，以70 kg成人体质量计，算得每只大鼠剂量2.08 g/（kg·d），用高压双蒸水配制分装，-80 ℃保存。1.4试剂与仪器胎牛血清（Gibco公司，美国，货号：10099141）；胰酶消化液（Gibco公司，美国，货号：25200056）；磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝科技有限公司，货号：P1020）；DMEM高糖培养基（Gibco公司，美国，货号：11965092）；Marker（雅酶生物科技有限公司，货号：WJ101）。RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P1003K）；BCA蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGP902）；5×蛋白上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1040）；飞克特超敏ECL发光液（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0186-1）；细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）抗体、P-ERK1/2抗体（武汉Proteintech公司，货号：16443-1-AP、28733-1-AP）；丝裂原活化蛋白激酶激酶1（MEK1）抗体（美国Santa Cruz公司，货号sc-6250），P-MEK1抗体、大鼠肉瘤病毒癌基因（RAS）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（英国abcam公司，货号分别为ab96379、ab108602、ab8227），山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G、山羊抗鼠IgG（武汉Proteintech公司，货号SA00001-2、SA00001-1）。离心机（德国Eppendorf公司，型号：5425R，离心半径8 cm）；倒置荧光显微镜（日本Nikon公司，型号：Ti2000）；超高压液相色谱仪（岛津，型号：Nexera X2）；质谱仪（AB Sciex公司，Triple TOF 6600）。

2 方法 2.1 供试品溶液的制备

取100 mg引火汤颗粒于1 mL水溶解，加入3 mL乙醇，超声提取10 min，溶液于4 ℃静置12 h冷却。冷却后于3 000 r/min，离心半径8 cm（下同），4 ℃离心10 min，取上清液，氮气吹干乙醇得精制液。质谱检测时加超纯水补足体积至1 mL，药液过0.22 µm滤膜备用，质谱进样10 µL，技术重复3次。

2.2 血清样品制备

将12只Wistar大鼠随机分为中药组和空白组（每组6只）。中药组按照2.08 g/（kg·d）的引火汤颗粒灌胃，空白组予等体积生理盐水灌胃。喂养7 d，末次给药后于0.5、1、2 h经尾静脉采集大鼠血样约1 mL；静置30 min后，4 000 r/min离心10 min，获取血清；合并同一大鼠的血清样本，-80 ℃保存备用。空白血清制备方法同上。

2.3 血清样本处理

每组取80 µL血清加入320 µL预冷的纯甲醇，振荡1 min，冰浴超声20 min，-20 ℃静置1 h，16 000×g 4 ℃离心20 min，取上清液，冻干，干燥后加入80 µL预冷的50%甲醇溶液复溶，再次以20 000×g、4 ℃离心15 min，取50 µL上清液备用。质谱分析时每个样本取10 µL进样，各重复1针。

2.4 色谱

整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中，样品采用超高效液相色谱系统，使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。柱温40 ℃，流速0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序：0~1 min保持0%B；1~2 min B线性升至30%；2~12 min B线性升至50%；12~21 min B线性升至100%；21~26 min维持100%B；26~26.1 min B线性降至0%；26.1~30 min维持0%B。

2.5 质谱

质谱检测采用电喷雾离子源（ESI），在正负离子扫描模式下进行，质量扫描范围为50~1 500 m/z。离子源温度设定500 ℃，正离子化电压+5 000 V，负离子化电压-4 500 V；离子源气体压力150 psi，帘气压力45 psi，去簇电压60 V，碰撞电压20 V，碰撞能量扩展15 V。

2.6 数据处理

采集到的质谱原始数据采用MS DIAL软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，运用二级质谱数据库，并结合与之相对应的裂解规律匹配方法，对数据中具备质谱信息的峰展开精准的物质鉴定工作。

2.7 引火汤靶点预测

从Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取引火汤入血成分SMIELS结构式，将其分别上传至Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）、PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）预测药物靶点，删除重复后获得引火汤入血成分靶点。将筛选获得的靶点蛋白输入UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），转化为标准靶基因。

2.8 肺腺癌相关靶点的获取

以“Lung adenocarcinoma”为关键词进行检索GeneCards（https://www.genecards.org/）及OMIM（https://omim.org/），合并得到肺腺癌相关的靶点。

2.9 引火汤入血成分-肺腺癌靶点拓扑分析

整合引火汤入血成分作用靶点与肺腺癌疾病靶点，筛选交集靶点，并利用在线工具构建韦恩图。将交集靶点集导入STRING（https:/string-db.org/）平台，设定物种为“Homo sapiens”，保留默认参数，构建蛋白质互作（PPI）网络。将蛋白相互作用信息导入Cytoscape 3.9.1软件，绘制蛋白互作网络图。根据degree值筛选出前6个为核心蛋白。

2.10 基因本体论（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析

基于DAVID数据库对药物-疾病交集靶点开展GO功能富集分析（覆盖生物过程BP、分子功能MF、细胞组分CC3个维度）及KEGG通路富集分析，物种限定为人类（Homo sapiens），设置显著性阈值P < 0.01筛选关键功能条目与通路，获取富集结果后通过微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化呈现。

2.11 含药血清制备

将28只雄性Wistar大鼠随机分为空白组与中药组（每组14只）。末次给药后2 h（给药后1~2 h达血药浓度峰值，时间过长导致药物代谢，无法发挥药效，末次给药1~2 h均可反映药效，因此选择该给药后2 h采血^[8]），通过腹腔注射2%戊巴比妥钠实施麻醉，经腹主动脉采集全血样本。血液标本先室温静置30 min，随后在4 ℃环境下以3 000 r/min离心20 min，分离获取血清上清液。将血清置于56 ℃水浴中灭活30 min，使用0.22 µm微孔滤膜进行过滤除菌，分装后于-80 ℃超低温冰箱中冻存备用。

2.12 细胞培养

将A549、H1299细胞系于细胞培养箱中培养，采用含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗的DMEM完全培养基进行培养。细胞生长至80%进行传代。

2.13 CCK8法测定含药血清干预最佳时间及浓度

取生长状态良好的A549、H1299细胞，调整成浓度为1×10⁵个/mL的细胞悬液，取100 µL细胞悬液接种在96孔板，细胞贴壁后，分为空白对照组（基础培养基）、对照组（20%空白大鼠血清+基础培养基），观察组：加入不同体积分数（5%、10%、15%、20%）的含药血清，在细胞培养箱中培养24、48、72 h后，在每个孔中加入10 µL的CCK-8试剂，孵育1 h，用酶标仪A490 nm检测各孔吸光度（OD值）。细胞活力=[观察组OD）值-空白对照组OD值]/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。

2.14 实验分组

A549细胞空白对照组：20%空白大鼠血清；10%引火汤组：10%引火汤含药血清+10%空白大鼠血清；引火汤+ML-098组：10%引火汤含药血清+10%空白大鼠血清+ML-098；H1299细胞空白对照组：20%空白大鼠血清；20%引火汤组：20%引火汤含药血清；引火汤+ML-098组：20% 引火汤含药血清+ML-098；A549细胞使用ML-098浓度为2 µmol；H1299细胞使用ML-098浓度为16 µmol^[9]。

2.15 划痕实验

将对数生长期的A549细胞与H1299细胞接种至6孔板培养，待细胞融合度达80%~90%时实施划痕操作。使用高压灭菌处理的200 µL枪头垂直板底划出直线，随后以PBS冲洗培养孔以去除脱落细胞。在0、48 h时对同一划痕处进行拍照，用Image J软件计算划痕面积，代入公式计算细胞划痕愈合率，实验重复3次。

2.16 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达

各组干预细胞用PBS洗涤3次后，加入含蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min。随后在4 ℃、12 000×g条件下离心15 min，收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，取15 µg总蛋白与上样缓冲液混合，经100 ℃变性10 min后，通过SDS-PAGE进行电泳分离，并转印至PVDF膜。用10%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入一抗在4 ℃孵育过夜，次日用二抗室温孵育1 h，最后以ECL超敏发光液显影，使用Image J软件对灰度值进行定量分析。

2.17 统计学方法

采用Graphpad Prism 9.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间差异用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

3 结果 3.1 入血成分鉴定

利用UHPLC-MS对引火汤进行定性分析，对各成分保留时间，二级碎片，误差值等进行提取分析，并结合标准品及相关文献推测其结构，结果引火汤中共鉴定出486个有效成分，所有化学成分主要分为15类，分别为蒽（8，1.73%）、苯及衍生物（26，5.63%）、羧酸及其衍生物（21，4.55%）、肉桂酸及其衍生物（17，3.68%）、香豆素及其衍生物（19，4.11%）、脂肪酰基（40，8.66%）、黄酮类化合物（51，11.04%）、异黄酮类化合物（13，2.81%）、有机氧化合物（31，6.71%）、酚类化合物（11，2.38%）、异戊二烯脂类（73，15.8%）、原小檗碱生物碱及其衍生物（9，1.95%）、甾体及其衍生物（30，6.49%）、单宁酸（14，3.03%）、其他（99，21.43%）。引火汤在正、负离子模式的总离子流色谱图（TIC）见图 1A、B。

通过对比分析引火汤颗粒、引火汤含药血清正负总离子流图（图 2）与空白血清总离子流图（图 3），分析相对分子质量、碎片信息以及结合文献，最终确定21个入血成分，见表 1。

3.2 网络药理学分析

通过TCMSP、Swiss Target Prediction、PharmMapper等数据库预测引火汤潜在作用靶点共有574个，通过Genecards、OMIM等数据库共收集到肺腺癌相关的作用靶点1 341个。通过将药物靶点和疾病靶点进行交集分析，获取引火汤与肺腺癌相关作用靶点共176个（图 4A）。PPI网络的构建和分析发现，其潜在作用的点为STAT3、TNF、EGFR、CASP3、JUN、MMP9、MAPK14等（图 4B）。

GO富集分析发现引火汤发挥作用的生物过程涉及表皮生长因子受体信号通路、血管内皮生长因子受体-1信号通路、干细胞因子受体信号通路等；分子功能包括ATP结合、配体激活受体活性、血小板衍生生长因子α受体活性等；细胞成分主要包括细胞溶质、受体复合物、细胞核、细胞质、细胞核质（图 5A）。KEGG富集分析共筛选了183条信号通路，主要包括癌症信号通路、RAS信号通路、MAPK信号通路等（图 5B），进一步通过文献分析，研究选择了MAPK/ERK信号通路进行验证。

3.3 CCK8法筛选引火汤干预浓度及时间

干预时长对A549及H1299细胞增殖的影响分析显示，A549细胞在48 h时呈现最显著的增殖抑制效应；而H1299细胞则表现出时间依赖性增殖抑制增强特征。鉴于实际实验中72 h H1299细胞出现明显细胞死亡现象，为确保实验数据可靠性，故选定48 h作为两株细胞的标准干预时长。在48 h干预时间点，含药血清对A549及H1299细胞增殖的剂量效应分析显示：A549细胞中，10%含药血清处理组表现出最显著的增殖抑制效应，因此选用10%含药血清干预A549细胞；而H1299细胞各浓度组（5%、10%、20%）均观察到明显的细胞活力下降，且20%浓度组呈现最优抑制效能。最终选定20%含药血清作为H1299细胞的干预浓度。见图 6。

3.4 引火汤对A549、H1299肺腺癌细胞的迁移

划痕实验结果显示，引火汤对A549细胞处理48 h后，该组细胞的迁移率相较于空白对照组呈现出显著抑制趋势（图 7）；同样，在以引火汤处理H1299细胞48 h的条件下，细胞的迁移率也显著低于空白对照组（图 8）。挽救实验中，A549和H1299细胞引火汤+ML098组的细胞迁移率与引火汤组相比，引火汤+ML098组细胞迁移能力得到回升，差异具有统计学意义（P < 0.05）。

3.5 引火汤对A549、H1299细胞MAPK/ERK通路相关蛋白表达的影响

使用Western Blot分析验证了网络药理学预测，引火汤可以抑制MAPK/ERK信号轴激活。与空白组相比，引火汤处理组A549（图 9）和H1299（图 10）细胞中：RAS蛋白，p-MEK/MEK、p-ERK/ERK表达均降低（P均 < 0.05）；与引火汤组相比，引火汤+ML-098组A549、H1299细胞RAS蛋白表达升高、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK升高（P均 < 0.05）。表明使用RAS激动剂ML-098后，上述抑制效应被逆转。

4 讨论

近年来，尽管肺腺癌的诊疗水平显著提升，但其远期生存率仍不理想，晚期患者5年生存率仅约20%^[10]，因此，亟待探索更有效的治疗策略，中医药在延缓肺腺癌进展方面展现出潜力。中医经典文献虽无“肺癌”病名记载，但基于辨证论治体系，通过四诊合参干预本病已取得较好的临床疗效。临床观察显示，现代手术、放化疗等治疗易耗伤阴精^[11]，损人气血，阴不足则无以制阳，导致虚阳上越，临床表现为上热下寒证候：头面烘热、口舌生疮、潮热盗汗、耳鸣如潮，双膝独冷，治疗不可误用苦寒直折，当滋阴清热，引火归原，临床上选用引火汤取得良好的疗效。引火汤出自陈士铎的《辨证奇闻》，主治咽喉肿痛属阴娥者^[12]，原方由熟地黄、麦冬、巴戟天、茯苓、五味子5味药组成。方中重用熟地黄，填补真阴而为君；麦冬、五味子滋肺，金水相生，以助熟地黄滋水为臣；其中五味子酸敛，固摄浮阳；茯苓健脾渗湿，培土伏火；巴戟天温肾助阳，引火归元，诸药合方起到滋阴清热、引火归原，使机体阴阳平衡，改善肺腺癌预后。然而，阐明中医药发挥作用的分子机制是当前研究的核心挑战，也是推动中药国际化的关键所在。为进一步探究引火汤复杂药效成分及机制，规避传统网络药理学数据库中的假阳性干扰。研究采用液质联用技术与网络药理学进行结合，精准鉴定引火汤的入血活性成分，系统预测其作用靶点及相关通路。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，共分析鉴定明引火汤入血成分21种，主要包括异戊二烯脂类、黄酮类、酚类化合物、蒽类化合物、香豆素及其衍生物等。文献研究表明，梓醇是地黄的主要抗癌成分，其可能通过激活环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）/干扰素基因刺激因子（STING）信号通路，抑制肺癌细胞的增殖及免疫逃逸发挥抗肿瘤作用^[13]。Qiao等^[14]研究表明，在结直肠癌中，梓醇可以通过沉默信息调节因子1（SIRT1）途径抑制细胞增殖。茯苓酸可通过激活共济失调-毛细血管扩张突变基因（ATM）/ATM与Rad3相关激酶（ATR）DNA损伤应答通路，诱导肿瘤细胞DNA损伤并促进凋亡^[15]。Wang等^[16]学者进一步发现，该化合物能显著抑制上皮-间质转化（EMT）过程，并下调基质金属蛋白酶（MMP）-2/MMP-9的表达，从而有效抑制肿瘤细胞增殖与侵袭。水晶兰苷作为巴戟天的重要活性成分，袁晗^[17]的研究证实水晶兰苷可以通过维生素D受体（VDR）信号通路抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。木脂素类化合物是五味子中的重要抗癌成分，木脂素能通过多靶点调控机制，有效抑制肿瘤细胞增殖与代谢^[18-19]。高异黄酮是麦冬发挥抗癌的主要活性成分，其在肺癌细胞中表现出良好的诱导细胞凋亡活性^[20]。上述活性成分可能是引火汤方剂发挥抗肿瘤作用的关键物质基础。

为了探索引火汤干预NSCLC的作用机制，本研究基于前期鉴定的21种入血成分，整合网络药理学与KEGG通路富集分析，预测表明引火汤可能通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路发挥抗NSCLC效应。RAS/RAF/MEK/ERK是线粒体激活蛋白激酶（MAPK）最重要的途径之一，其起源于细胞膜上的受体（如酪氨酸激酶RTKS等），其响应细胞因子、激素、物理信号等多种胞外信号^[21]，RAS作为该通路的上游分子，通过三磷酸鸟苷（GTP）/二磷酸鸟苷（GDP）结合态切换充当分子开关，配体与RTKS等受体结合后催化RAS-GDP转化为活性态RAS-GTP^[22]，RAS-GTP能够激活RAF激酶，使RAF磷酸化，RAF磷酸化后会进一步激活MEK，MEK进一步磷酸化激活ERK，激活的ERK能够穿过核孔进入细胞核，磷酸化多种转录因子，调控增殖、侵袭等恶性表型相关基因表达^[23-25]。

本研究仍存在一定局限性，仅涉及细胞实验，缺乏动物水平的验证；此外，引火汤中已鉴定的活性成分间的相互作用及其对关键通路的协同调控机制尚未明确，未来研究可结合动物模型、类器官培养及多组学技术等，深入解析其“多成分-多靶点-多通路”的作用网络。

综上，引火汤可通过下调RAS蛋白表达及MEK、ERK磷酸化水平，阻断MAPK/ERK信号通路活化，从而抑制肺腺癌细胞迁移能力。这一发现不仅从现代药理学角度诠释了引火汤“滋阴清热、引火归原”治疗肺腺癌上热下寒证的科学内涵，也为中医药通过多靶点、整体性调控干预肿瘤进程提供了新的研究思路与实验依据。