2026, Vol. 43文章信息
- 刘述, 刘雨桐, 于鲁, 等.
- LIU Shu, LIU Yutong, YU Lu, et al.
- 通脉养心方调控MFN2/PERK信号通路改善缺氧复氧心肌细胞损伤的机制研究
- Mechanism of Tongmai Yangxin Prescription in ameliorating hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte injury via the MFN2/PERK signaling pathway
- 天津中医药, 2026, 43(7): 894-903
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(7): 894-903
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.07.11
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- 收稿日期: 2026-04-25
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2. 北京中医药大学东方医院秦皇岛医院（秦皇岛市中医医院），秦皇岛 066000
心血管疾病已成为中国居民健康首要威胁，《中国心血管健康与疾病报告2024》显示，中国心血管疾病（CVD）患者超3.3亿，冠心病（CHD）患病人数达1 234.11万，疾病负担沉重[1]。MIRI是指心肌组织出现缺血缺氧，再灌注后进一步导致心肌继发性损伤的病理现象，是冠心病再灌注治疗后常见的比较棘手的临床问题[2-4]。
通脉养心方具有益气养阴、通脉止痛之效，现广泛应用于心血管疾病的临床治疗[5]。现代药理研究表明，通脉养心方能够显著减轻氧化应激对心肌细胞的损伤，改善心肌能量代谢紊乱和氨基酸代谢异常，缓解心肌细胞的能量供应不足和功能失调，保护心肌细胞结构和功能完整性[6-7]，并能通过上调雌激素受体（ERα）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）基因及p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平，缓解心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）引起的心脏损伤[8]。在此过程中，线粒体作为能量代谢中心，通过氧化磷酸化途径生成ATP，其功能不足会导致能量供应减少，进一步加重心肌损伤[9]。线粒体融合蛋白2（MFN2）作为调控线粒体融合的关键蛋白。研究表明，MFN2在维持线粒体膜动态平衡、细胞增殖、凋亡及氧化代谢中起重要作用[10]。其表达异常可导致线粒体功能紊乱，进而引发高血压病、心肌缺血/再灌注损伤及扩张性心肌病等心血管疾病[11]。蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）是一种位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白。有研究显示，抑制PERK可以减少内质网应激诱导的自噬，从而减轻心肌细胞凋亡[12]。以上研究提示，通脉养心方可能通过MFN2/PERK信号通路改善心肌细胞线粒体结构和功能，抑制细胞凋亡，从而起到保护作用。
通脉养心方虽在防治MIRI方面表现出了潜在的临床应用价值，但其作用的分子机制尚不明确。因此，缺氧复氧（H/R）细胞模型给予通脉养心方干预，以MFN2/PERK信号通路为切入点，通过对线粒体功能、结构、凋亡和关键基因蛋白表达水平的研究，探讨通脉养心方改善MI/RI的机制。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂通脉养心丸（天津中新药业集团乐仁堂制药厂，批号1070946，规格：每10丸质量为1 g）；盐酸曲美他嗪片（江苏吴中医药集团有限公司，批号：H20073709，剂型：片剂，规格：每片含有效成分20 mg）；增强型三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，S0027）、增强型线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1，上海碧云天生物技术有限公司，C2003S）；活性氧（ROX）检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，CA1410）；SeahorseXF细胞线粒体压力测试试剂盒（安捷伦科技有限公司，103015-100）；GAPDH抗体[中国生工生物工程（上海）股份有限公司，D110016]；MFN2抗体（A19678）、C/EBP同源蛋白（CHOP）抗体（A20987）、真核翻译起始因子2α（EIF2α）抗体（21221）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2，A19693），中国武汉爱博泰克（Abclonal）生物科技有限公司；p-EIF2α抗体（F15N7）、Bax（L6B9），美国Selleck生物科技有限公司；PERK（3192），美国CellSignalingTechnology生物技术公司；p-PERK（65187），美国SAB（SignalwayAntibody）生物科技有限公司；激活转录因子4（ATF4，10835-1-AP），武汉三鹰生物技术有限公司；活化的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3，YM8294），Immunoway生物科技有限公司。本研究动物实验相关操作均获得天津中医药动物伦理委员会的批准，项目批准号：TCM-LAEC2022229。
1.2 药物配制取50 g通脉养心丸粉碎过筛后，500 mL 70%乙醇为溶剂，超声提取后过滤，重复提取3次，合并滤液后经预冻及冷冻干燥制得冻干粉，避光密封保存于4 ℃棕色玻璃瓶。
1.3 造模与分组将复苏的H9c2细胞转入含有10% HI-胎牛血清（FBS）高糖含酚红培养基中，置于37 ℃、湿度95%、5%CO2的恒温培养箱中进行单层培养。细胞密度达到80%~85%，替换为不含FBS的无糖培养基，并将细胞置于37 ℃、95%N2、5%CO2的密闭缺氧小室中缺氧处理6 h，通入高纯氮气维持低氧环境；恢复FBS和葡萄糖供应，添加通脉养心方70%乙醇提取物，将细胞转移至正常37 ℃、5%CO2的CO2培养箱中复氧培养24 h。根据实验要求，将H9c2心肌细胞分为6组：1）空白组：正常培养基。2）模型组：H/R处理。3）通脉养心方低剂量组（H/R+25 µg/mL通脉养心方70%乙醇提取物）。4）通脉养心方中剂量组（H/R+50 µg/mL通脉养心方70%乙醇提取物）。5）通脉养心方高剂量组（H/R+ 100 µg/mL通脉养心方70%乙醇提取物）。6）曲美他嗪（TMZ）组（H/R+ 80 µg/mL TMZ）。
1.4 噻唑蓝（MTT）法检测H9c2细胞活性将H9c2心肌细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中。分别用不同浓度的通脉养心方处理24 h后，向每孔中加入10 µL的MTT溶液。在37 ℃孵箱放置4 h后，弃各孔溶液并加入100 µL二甲基亚砜，静置20 min，用酶标仪测量每孔在490 nm的吸光度。
1.5 荧光探针检测ROS水平造模后将细胞培养至6孔板生长密度约为80%，按实验分组处理后，按照1∶1 000比例用无血清DMEM培养液稀释DCFH-DA，37 ℃避光孵育10 min，收集细胞沉淀后预热洗3次，使用流式细胞仪进行检测与分析。
1.6 透射电镜观察线粒体超微结构胰酶消化处理后，加入培养基终止反应，轻柔吹打使细胞脱落并悬浮。将细胞转移至离心管低速离心3~5 min。弃去上清液并加入已恢复至室温的电镜固定液，将细胞团吹散重悬。室温避光固定30 min后转入4 ℃保存。
1.7 Mito Tracker探针标记线粒体结构将Mito-Tracker Green探针用无水DMSO溶解，配制成1 mmol的储存液，-20 ℃下避光保存。根据上述实验分组造模后，加入配制好的37 ℃预温工作液，孵育15~45 min。进行细胞核荧光标记：使用磷酸缓冲盐溶液（PBS）将Hoechst 33342活细胞染色液稀释100倍，室温放置3~5 min。染色结束后，使用PBS进行2~3次浸润清洗，每次持续3~5 min。用抗荧光淬灭封片剂封片后在激光共聚焦显微镜下进行观察和拍照。
1.8 ATP水平的检测将ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 µg/mL。室温取100 µL ATP工作液加入20 µL样品或标准品，迅速混匀，间隔2 s后，用化学发光仪测定RLU值。根据标曲计算样品中的ATP含量。采用BCA法进行蛋白定量标准化处理。
1.9 JC-1染色检测线粒体膜电位水平将H9c2细胞接种于6孔板，按实验分组处理后。每孔加入1 mL预先配置的JC-1工作液。避光37℃孵育20 min。1×JC-1缓冲液洗涤细胞2次，染色结束后，每个样品加入0.5 mL DMEM培养基，用流式细胞仪进行检测及分析。
1.10 线粒体呼吸功能检测每孔加入20 µL 1×多聚赖氨酸，将探针板置于烘箱中过夜风干。将细胞种在特定的96孔板中按照分组处理。将300 µL葡萄糖、丙酮酸盐、谷氨酸盐分别加入30 mL不含酚红的DMEM中。洗孔两次，加入180 µL检测液置于无CO2的培养箱中培养45 min进行排CO2操作。依次吸取160 µL检测液，80 µL寡霉素母液，190 µL检测液加入50 µL鱼藤酮/抗霉素A（R/AA），120 µL检测液加入120 µL羰基氰化物-4-三氟甲氧基苯腙（FCCP）配制药物。取出排空CO2的探针板，A孔加入20 µL稀释好的寡霉素，B孔加22 µL FCCP，C孔加25 µL视黄酸受体α（R/AA），使寡霉素终浓度为2.25 µmol/L，FCCP终浓度为2.75 µmol/L，R/AA终浓度为1.56 µmol/L。仪器校准后进行上机检测。
1.11 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测RNA提取：6孔板加入Trizol处理细胞。裂解细胞后室温静置离心，重复2次。取上层水相，加入等量异丙醇颠倒混匀静置15 min后离心。弃上清，加入1 mL DEPC水配制的预冷75%乙醇，轻柔混匀后离心。弃上清，室温晾干加入DEPC处理水溶解RNA沉淀。采用Nano Drop超精度核酸分光光度计进行RNA纯度及浓度测定。逆转录合成cDNA：按照试剂盒说明书配制反应体系，使用反转录仪将体系进行cDNA合成反应，反应结束后短暂离心并冷却。cDNA扩增：根据UltraSYBR Mixture（Low ROX）试剂盒操作指南计算需使用的反应体系，最终配制总体积为50 µL反应体系。并委托上海生工生物工程技术服务有限公司，设计引物，引物序列见表 1。获得每个样品每次反应的Ct值，再计算得到ΔCt，ΔCt=待测基因Ct值－内参照基因Ct值。与模型组相比后，取2-ΔΔCt值进行数据统计。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| MFN2 | 上游: GGAGTGGTGTGGAAGGCAGTG 下游: GTCCAGGTCAGCCGCTCATAC |
| ATF4 | 上游: AGTCTGCCTTCTCCAGGTGTTCC 下游: GCTGCTGTCTTGTTTTGCTCCATC |
| EIF2α | 上游: AGTGGAGGTGTCAACAGAGGAGTC 下游: TTCATTGGTTCGTGGCTGTCTGG |
| CHOP | 上游: TCACAAGCACCTCCCAAAGCC 下游: CACTGACCACTCTGTTTCCGTTTC |
| PERK | 上游: GCGACATGGAAGATGGTACAGTGG 下游: CCTGCTGCTGGAGTGCTTGAAC |
| Bax | 上游: GACGCATCCACCAAGAAGCTGAG 下游: GCTGCCACACGGAAGAAGACC |
| Bcl-2 | 上游: TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATG 下游: GGTGTGCAGATGCCGGTTCAG |
| Caspase-3 | 上游: ACGAACGGACCTGTGGACCTG 下游: GTTTCGGCTTTCCAGTCAGACTCC |
按照分组处理后，采用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，收集各组细胞，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，将蛋白样品SDS-PAGE电泳分离后，湿转法转至PVDF膜，将PVDF膜室温封闭后依次加入一抗：GAPDH抗体、MFN2抗体、CHOP抗体、EIF2α抗体、p-EIF2α抗体和内参GAPDH，4 ℃孵育过夜。次日，兔抗二抗（1∶5 000）稀释液室温摇床孵育2 h。最后用TBST冲洗3次。用滤纸去除残留水分并浸入ECL化学超敏发光液中，用多功能成像系统进行曝光并拍照保存，用Image J软件计算条带灰度值。
1.13 统计学方法采用SPSS 26.0软件进行数据分析，采用Image J软件对条带的灰度值进行统计分析。实验结果以均数±标准差（x±s）表示。若数据属于正态性分布且方差齐，采用单因素方差分析；若数据属于非正态分布，采用非参数检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 通脉养心方对H9c2细胞活性和氧化应激反应的影响在未对细胞进行造模处理的情况下，给予浓度分别为25、50、100、200、300和400 µg/mL的通脉养心方70%乙醇提取物。MTT检测结果表明，当药物浓度在25、50、100、200 µg/mL时，细胞活力均持续升高，在100 µg/mL组最高。当对细胞进行缺氧复氧造模处理后，细胞在缺氧复氧后细胞活力较空白组明显降低（P < 0.01），使用不同浓度通脉养心方干预后，细胞活力上调，且在浓度在100 µg/mL时细胞活力达到最高，而在浓度为200 µg/mL时细胞活力降低，依据H/R模型细胞活力的结果，将后续的细胞实验药物浓度定为25、50、100 µg/mL。见图 1A、B。
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| 注：图A，不同浓度通脉养心方对H9c2细胞活性的影响；图B，不同浓度通脉养心方对缺氧复氧模型下H9c2细胞相对细胞活性的影响；图C，通脉养心方对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞线粒体活性氧水平的影响；图D，流式细胞仪检测不同浓度通脉养心方对缺氧复氧模型下H9c2心肌细胞活性氧水平的影响。与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。n=6。 图 1 不同浓度通脉养心方下H9c2细胞活性和线粒体活性氧水平 Fig. 1 Effects of varying concentrations of Tongmai Yangxin Prescription on H9c2 cell viability and mitochondrial ROS levels |
采用DCFH-DA探针检测H9C2细胞ROS水平，结果表明，与空白组相比，模型组的线粒体ROS水平均显著升高，差异具有统计学意义（P < 0.01）；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方和TMZ药后，细胞内线粒体ROS含量呈剂量依赖性降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）。流式细胞仪检测结果显示，与空白组相比，模型组细胞的荧光强度显著右移，平均荧光强度急剧增强，差异具有统计学意义（P < 0.01）。与模型组相比，经不同通脉养心方和对照药TMZ干预后，各给药组的荧光峰出现剂量依赖性降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）。见图 1C、D。
2.2 通脉养心方对H9c2心肌细胞线粒体结构和功能的影响 2.2.1 通脉养心方对H9c2心肌细胞线粒体结构的影响透射电镜结果显示：空白组H9c2心肌细胞线粒体数量丰富，分布较均匀，基质均匀、嵴排列较整齐。与空白组相比，模型组细胞线粒体数量较少、分布不均，线粒体膜损伤严重，嵴断裂、变短或溶解，基质溶解、外溢，少数线粒体嵴髓样变，单层结构的自噬小体较多；通脉养心方高剂量组心肌细胞仍有中度偏重度退行性变，线粒体数量相对较多、分布不均，偶有单层结构的自噬小体，较模型组线粒体状态明显得到改善。见图 2A。Mito Tracker探针标记法结果显示，与空白组相比，模型组的线粒体长度缩短，线粒体碎片化水平升高；与模型组相比，给予不同浓度通脉养心方和TMZ后，各组细胞内线粒体长度和线粒体完整性不变。实验结果提示，通脉养心方可以有效改善缺氧复氧H9c2心肌细胞的线粒体完整性。见图 2B。
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| 注：图A，透射电镜下通脉养心方对缺氧复氧心肌细胞线粒体超微结构的影响；图B，激光共聚焦显微镜观察通脉养心方对H9c2心肌细胞缺氧复氧条件下线粒体结构的影响；图C，通脉养心方对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞ATP水平的影响；图D和图E：通脉养心方对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响。与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。n=3。 图 2 不同浓度通脉养心方下H9c2细胞线粒体结构 Fig. 2 Mitochondrial morphology of H9c2 cells under varying concentrations of Tongmai Yangxin Prescription |
与空白相比，模型组细胞内ATP含量显著降低；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方和TMZ时，缺氧复氧H9c2心肌细胞内ATP的含量显著提高，并且随通脉养心方浓度的升高而升高，差异具有统计学意义（P < 0.05，见图 2C）。JC-1染色检测结果显示，与空白组相比，模型组的线粒体膜电位水平显著下降；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方和TMZ后，细胞内线粒体膜电位显著升高，差异具有统计学意义（P < 0.05，见图 2D、E）。
2.2.2 通脉养心方对H9c2心肌细胞线粒体功能的影响Seahorse XF细胞能量代谢仪检测结果显示，与空白组相比，模型组能够显著降低H9c2细胞的基础呼吸率、最大呼吸和偶联ATP合成含氧量；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方，H9c2细胞的基础呼吸率和最大呼吸和偶联ATP合成含氧量显著提高，差异具有统计学意义（P < 0.01）。见图 3。
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| 注：Oligomycin，寡霉素; FCCP，羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；Antimycin A & Rotenone，抗霉素A和鱼藤酮。与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.01。n=3。 图 3 通脉养心方对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞线粒体呼吸功能的影响（x±s） Fig. 3 Effect of Tongmai Yangxin Prescription-mediated regulation of mitochondrial respiration in H9c2 cells following H/R (x±s) |
与空白组相比，模型组MFN2 mRNA表达量显著降低，PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达量显著升高；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方和TMZ药后，H9c2心肌细胞MFN2 mRNA表达量显著升高，PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达量显著降低，具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
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| 注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。n=3。 图 4 通脉养心方对缺氧复氧H9c2心肌细胞基因表达水平的影响（x±s） Fig. 4 Effect of Tongmai Yangxin Prescription on gene expression in H9c2 cardiomyocytes under H/R (x±s) |
与空白组相比，模型组MFN2、Bcl-2蛋白表达量明显降低，p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达量明显升高；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方和TMZ药后，H9c2心肌细胞MFN2蛋白表达量明显升高，具有剂量依赖性，p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP白表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 5。
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| 注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。n=3。 图 5 通脉养心方对缺氧复氧H9c2心肌细胞中蛋白表达水平的影响（x±s） Fig. 5 Effect of Tongmai Yangxin Prescription on protein expression in H9c2 cardiomyocytes under H/R (x±s) |
与空白组相比，模型组Bax、Caspase-3 mRNA表达量明显升高，Bcl-2 mRNA表达量明显下降，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方和曲美他嗪药后H9c2心肌细胞Bax、Caspase-3 mRNA蛋白表达量明显下降，Bcl-2 mRNA表达量明显升高，并具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。
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| 注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。n=3。 图 6 通脉养心方对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡基因表达水平的影响（x±s） Fig. 6 Effect of Tongmai Yangxin Prescription on apoptotic gene expression in H9c2 cardiomyocytes following H/R (x±s) |
与空白组相比，模型组Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达量明显升高，Bcl-2蛋白表达量明显下降，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与模型组相比，当给予不同浓度通脉养心方和TMZ药后H9c2心肌细胞Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达量明显下降，Bcl-2蛋白表达量明显升高，并具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 7。
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| 注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。n=3。 图 7 通脉养心方对缺氧复氧H9c2心肌细胞中凋亡蛋白表达水平的影响（x±s） Fig. 7 Effect of Tongmai Yangxin Prescription on apoptotic protein expression in H9c2 cardiomyocytes following H/R (x±s) |
通脉养心方是在经典复方炙甘草汤与生脉饮基础上化裁而成的，组成包括生地黄、炙甘草、鸡血藤、麦冬、制何首乌、阿胶、五味子、党参、龟甲、大枣、桂枝11味中药，以益气养阴、通脉止痛为治则，针对气阴两虚、心脉瘀阻之病机[8]。方中甘草与地黄相须为用，共为君药，针对本病气阴两虚之主证。党参、制何首乌、麦冬、五味子4味药协同为臣，助君药益气滋阴。佐以鸡血藤、阿胶、醋龟甲，既能滋养阴血，又可通脉止痛。桂枝、大枣为使，温通经脉，兼能调和诸药。本方配伍精妙，诸药合用，现代药理学研究表明[13-14]，炙甘草中的三萜皂苷、黄酮类、多糖、香豆素和生物碱等具有抗动脉粥样硬化、抗炎、抗菌、抗氧化等作用[15-19]；麦冬的甾体皂苷与五味子木脂素能抗心肌缺血、减轻缺氧/复氧损伤并增强抗氧化酶活性[20-22]；桂枝中的桂皮醛等成分可扩张血管、改善冠脉循环[23-24]；生地黄与鸡血藤中的黄酮及酚酸类成分则表现出显著的抗氧化、清除自由基及抗动脉粥样硬化作用[25-27]。这些已知的药理作用，共同构成了通脉养心方发挥心肌保护效应的潜在物质基础。
心脏对能量需求极高，当血供受阻时，氧气供应不足，心肌细胞线粒体的氧化磷酸化过程受到抑制，ATP生成减少，ROS大量生成，而这些ROS又会对线粒体呼吸链造成进一步损伤，从而形成一个恶性循环[24]。氧化应激的过度激活又会改变线粒体功能蛋白和线粒体DNA等重要物质，引发细胞死亡，最终导致心脏功能障碍[23]。线粒体作为细胞能量代谢的核心细胞器，其结构完整性与心肌细胞功能直接相关。线粒体膜通透性改变导致线粒体内的细胞死亡因子释放，这些因子通过激活Caspase导致细胞凋亡。课题组前期研究发现通脉养心方能够通过改善心肌能量供应障碍和氨基酸功能障碍，减轻氧化应激和炎症[28-29]。本研究通过透射电镜观察到，H/R损伤后线粒体出现明显肿胀、嵴结构断裂及空泡化，表明氧化磷酸化功能受损。通脉养心方干预后，线粒体形态得到显著改善，结构趋于完整。Mito Tracker荧光染色进一步证实，通脉养心方可减轻H/R诱导的线粒体碎片化，维持线粒体网络连续性。与模型组相比，通脉养心方还显著提升了线粒体膜电位，有效缓解了H/R引起的线粒体膜通透性转换孔异常开放。ATP水平随药物浓度增加而回升，提示通脉养心方增强了氧化磷酸化效率。Seahorse能量代谢分析显示，通脉养心方各剂量组均能提高基础呼吸率、最大呼吸能力及ATP合成偶联耗氧量，表明其对电子传递链功能具有全面改善作用。
MFN2能够通过形成同源或异源二聚体把相邻的两个线粒体与MFN1连接，进而介导线粒体外膜（OMM）融合[30]。该蛋白质还参与线粒体融合并调节钙从内质网（ER）到线粒体的转移[9，11]，能够调节线粒体功能。PERK是一种位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，在其非活性状态下与葡萄糖调节蛋白（GRP78）结合。PERK被认为是在线粒体相关内质网膜（MAMs）的重要组成部分，PERK本身的活性可以被特异性的磷酸酶去磷酸化抑制，所调控的信号途径在心力衰竭、MIRI等病理过程中发挥重要作用，PERK改变了MAMs接触位点并减少了线粒体网络碎片化[31]。有研究显示，抑制PERK可以减少内质网应激诱导的自噬，从而减轻心肌细胞凋亡[12]。MFN2是内质网应激（ERS）反应期间细胞凋亡和自噬正常激活所必需的，MFN2缺陷通过持续激活PERK导致线粒体功能障碍，PERK分支参与蛋白质合成的减少和自噬，细胞凋亡和伴侣表达的激活[32-33]，进一步激活EIF2α、ATF4抑制蛋白质合成并驱动促细胞凋亡，激活CHOP并上调通过诱导促凋亡蛋白[34]。MFN2被发现，能够调节线粒体功能，像钙离子平衡、蛋白质合成、线粒体的融合、线粒体自噬以及炎症反应[35-36]。已有研究表明MFN2与动脉粥样硬化进展、血管成形术后血管再狭窄以及心脏肥大和衰竭等心血管疾病有关[37]。本研究结果也发现，当给予不同浓度通脉养心方后，H9c2心肌细胞MFN2和PERK基因以及MFN2和p-PERK蛋白的表达水平均显著升高。提示通脉养心方可能通过增强MFN2表达，间接抑制PERK通路活化，从而缓解ERS及其介导的线粒体损伤。
研究显示，ERS可以通过PERK/ATF4通路抑制ATF4过表达促进血管内皮细胞损伤，从而刺激细胞凋亡[38]。EIF2α是蛋白质合成过程中的关键调控因子，CHOP被认为是ERS的一种特异性转录因子，是心血管疾病中参与ERS相关凋亡信号传导的最广泛研究的生物标志物[39]。有研究发现，小鼠心脏I/R造模后会激活P-EIF2α/ATF4通路，上调CHOP基因表达[40]。CHOP下游靶基因是抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，通过调节Bcl-2和Bax之间的平衡来调控细胞凋亡[41]。当CHOP大量表达时，会促进Bax的上调并抑制Bcl-2的表达，从而推动细胞凋亡的进程[42]。当Bcl-2表达下调时，细胞凋亡中起关键作用的Caspase-3表达显著增加，进一步加速了细胞凋亡。CHOP作为PERK通路下游促凋亡因子，其下调进一步印证了通脉养心方通过抑制PERK-CHOP-Bax/Caspase-3轴减轻凋亡[41-42]。本研究中，当给予不同浓度通脉养心方后，H9c2心肌细胞的EIF2α、ATF4、CHOP基因与P-EIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著降低。细胞凋亡相关因子Cleaved Caspase-3、Bax的基因和蛋白表达均显著下降，Bcl-2的基因和蛋白表达水平显著上升。此结果进一步印证了通脉养心方作用机制的正确性。
课题组前期研究表明，以“益气养阴”为治则的通脉养心方对冠心病疗效显著[43-44]。本研究通过建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型，从细胞、分子及超微结构层面系统探讨了通脉养心方的心肌保护机制。综上，通脉养心方通过上调MFN2表达、抑制PERK/EIF2α/ATF4/CHOP信号通路活化，进而调控Bcl-2/Bax平衡并抑制Caspase-3表达，且通脉养心方能够剂量依赖性地改善H/R引起的线粒体损伤，显著恢复线粒体膜电位、提升ATP合成水平、增强线粒体呼吸功能，并减轻氧化应激，最终减少细胞凋亡。
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