肺炎支原体肺炎（MPP）是指肺炎支原体（MP）感染所致的肺部炎症疾病^[1-2]。该疾病主要累及肺泡与肺间质，进一步可侵犯支气管及细支气管，导致气道黏膜及黏膜下组织的炎症反应，是学龄前期和学龄儿童群体中高发的社区获得性肺炎（CAP）^[3-4]。值得关注的是，近年来临床数据显示，对大环内酯类药物治疗反应不佳的病例逐渐呈上升趋势^[5]。这种耐药现状使得病程迁延、气道高反应性持续等后遗症发生率显著上升^[6-7]，亟需探索新的治疗策略。MP感染以发热、痉咳、黄痰等为主要症状^[8]，中医称之为“肺炎喘嗽”，始见于《麻科活人全书》，其云：“喘而无涕，兼之鼻煽”。其基本病机在于痰热闭肺，气液流通不畅。宣肺清络方是天津中医药大学第二附属医院院内经验方，课题组前期临床研究已证实，宣肺清络方能有效治疗儿童支原体肺炎。现代研究证明，MPP痉咳与核因子-κB（NF-κB）调控的多种炎性因子表达相关，由此推测儿童MPP痉咳与Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/NF-κB信号转导通路及下游炎性因子表达相关，宣肺清络方可通过调控这一通路及相关因子发挥效应，探赜宣肺清络方治疗MPP痉咳的可能作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

本实验所用Wistar大鼠^[9]均为雄性，体质量（150±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物实验许可证编号：SCXK（京）2021-0011。饲养环境严格遵循规范要求，相对湿度50%±5%，内环境温度（25±2）℃，节律光照、保障饮水、自由摄食。本研究通过天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号：TCM-LAEC2022130）。

1.2 药物

本研究纳入宣肺清络复方颗粒剂^[10]。其组方配伍包含以下药材：炙麻黄6 g，金银花10 g，黄芩10 g，炒僵蚕10 g，炙桑白皮10 g，甘草6 g，生石膏20 g，鱼腥草20 g，炒冬瓜子10 g，桃仁6 g，炒莱菔子10 g，瓜蒌20 g，地龙10 g。该复方制剂由天江药业有限公司供应，均经严格核验，可满足后续实验研究。

本实验所用阿奇霉素干混悬剂（商品名：希舒美，批号H10960112），由辉瑞公司生产制备，药物规格：0.1 g。

1.3 MP培养

肺炎支原体国际标准株（ATCC，15531），购自American Type Culture Collection（ATCC）官方授权渠道。在易生源检测技术服务（天津）依据相关要求进行标准化保藏。将冻存的MP菌株接种置于37 ℃、5%CO₂恒温培养箱中静置培养。

1.4 主要试剂及仪器

二甲苯（货号：10023418）、伊红染液（货号：ZLI-9613）；过硫酸铵（货号：A1004），北京普利莱有限公司；变性缓冲液（货号：15596026），ThermoFisher Scientific；Ultra SYBR mixture（货号：CW2601H），康为世纪。

酶标检测仪（型号：DNM-9602），北京普朗科技有限公司；脱水机（型号：LEiCA TP-1020）、病理切片机（型号：LEiCA HistoCore MULTICUT），徕卡仪器有限公司；恒温箱（型号：BPG-9106A），金华市华速科技有限公司；显微镜（型号：OLYMPUS CKX43-LP），OLYMPUS；雪科制冰机（型号：IMS-50），雪科IMS。

1.5 动物造模与干预

为构建支原体肺炎痉咳大鼠模型，本实验采用支原体培养液滴鼻联合烟熏法及辣椒素溶液雾化激发法，参照相关文献方法，支原体肺炎组于第1、4、7天，以10%水合氯醛溶液按300 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，用1 mL注射器将1×10⁷ CCU/mL肺炎支原体培养液缓慢滴鼻，每日1次，每次0.1 mL，诱导大鼠气道炎症。支原体肺炎痉咳组及各药物组，每日置于自制熏箱（4 cm× 30 cm×40 cm），用13支香烟进行烟熏15 min，每日1次，连续7 d。烟熏结束后第1、4、7天，按上述方法进行MP感染。辣椒素雾化激发于烟熏结束后的第2、3、5、6天实施，将支原体肺炎痉咳组和各药物组大鼠置于透明密闭容器中^[11]，以1×10^-4 mol/L辣椒素溶液雾化吸入激发，每次3 min，每日1次^[1]。每日观察并记录各组大鼠一般状态、行为学变化及咳嗽发生情况，并结合MP DNA定量结果，提示造模成功。

造模成功后，空白组、支原体肺炎组、支原体肺炎痉咳组给予生理盐水灌胃，单次剂量8 mL，每日2次。西药组63 mg溶于4 mL无菌生理盐水中，每日1次。中药组取14 g药物溶于8 mL无菌生理盐水中，充分溶解后灌胃，每日2次。中西医结合组采用联合给药方式，阿奇霉素63 mg溶于4 mL无菌生理盐水中（每日1次灌胃），将宣肺清络方14 g，溶于8 mL生理盐水中（每日2次灌胃）。所有组别连续灌胃7 d，安乐死大鼠并收集大鼠血清肺组织用于后续酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白免疫印迹法（Wester blot）、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）等检测。

1.6 观察指标及方法 1.6.1 ELISA检测大鼠血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）炎症因子水平的变化

采集尾静脉血3 mL，置于无菌离心管中，离心后分离血清，置于-70 ℃超低温冷冻保存，统一待测。严格参照ELISA定量检测试剂盒说明书中的标准操作流程，以确保结果的准确性。

1.6.2 Western blot检测大鼠肺脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平的变化

称取冻存肺组织后，先使用眼科剪将其剪碎成小块（约1~2 mm³），以便后续处理。根据所测得的蛋白浓度，在总蛋白样品中加入适量体积的5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，轻柔混合均匀。随后，将稀释的二抗加入体系中，在室温条件下孵育1 h，进行信号显影，实验数据被妥善保存，最后获取条带进行灰度分析，以确定蛋白的相对表达水平。

1.6.3 qRT-PCR法检测肺组织中IL-6、IL-8、TNF-α以及TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平

按照试剂盒说明书，从大鼠肺组织中提取总RNA，并将其逆转录为cDNA。以该cDNA为模板，进行qPCR反应。取组织样品50 mg分别放入盛有1 mL变性缓冲液（TRIZOL）的EP管中^[12]，在高速低温组织研磨仪中充分匀浆。正向引物与反向引物各1.0 µL ddH₂O加至21.0 µL。反应条件设置为：95 ℃ 10 min；每个循环由95 ℃变性15 s和62℃退火延伸1 min组成。通过2^-ΔΔCt法计算相对表达水平，引物序列见表 1，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.7 统计学方法

本实验所有数据均采用SPSS 22.0统计软件进行系统化分析与处理，数据分布以均数±标准差（x±s）表示，差异性检验采用单因素方差分析。若经检验提示不同组间存在统计学差异，则进一步采用Bonferroni两两比较法进行事后检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 模型验证

MP DNA定量结果显示支原体肺炎组、支原体肺炎痉咳组感染大鼠肺组织中均有MP DNA表达，显示造模成功。见表 2。

2.2 各组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比较

与空白组相比，支原体肺炎组、支原体肺炎痉咳组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α含量明显上升（P < 0.05或P < 0.001）；经治疗后，与支原体肺炎痉咳组相比，用药组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平降低（P < 0.01或P < 0.001）。见表 3。

2.3 各组大鼠肺脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平的变化

与空白组相比，支原体肺炎组肺脏组织TLR4、MyD88、NF-κB水平升高（P < 0.001）；支原体肺炎痉咳组大鼠肺脏组织TLR4、MyD88、NF-κB水平升高（P < 0.01或P < 0.001）。与支原体肺炎痉咳组相比，中药组、西药组、中西医结合组大鼠肺脏组织TLR4、MyD88水平降低（P < 0.001）。中药组大鼠肺脏组织NF-κB水平明显降低（P < 0.01），西药组、中西医结合组大鼠肺脏组织NF-κB水平降低（P < 0.001）。各组大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白电泳图见图 1。见表 4。

2.4 各组大鼠肺组织中IL-6、IL-8、TNF-α以及TLR4、MyD88、NF-Κb mRNA表达水平

与空白组相比，支原体肺炎组大鼠肺脏组织TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8水平升高（P < 0.001或P < 0.01或P < 0.05）；支原体肺炎痉咳组大鼠肺脏组织TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8水平明显升高（P < 0.01）；与支原体肺炎痉咳组相比，中药组、西药组、中西医结合组大鼠肺脏组织TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8水平显著降低（P < 0.001）。见表 5。

3 讨论

已知MPP患儿在肺部感染后可引发的咳嗽症状多表现为痉挛性、刺激性干咳、部分情况可进展为感染后持续性咳嗽。此类症状特征与MP感染诱导气道高反应密切相关^[1]。科研团队前期开展的相关动物研究表明，MP感染可导致大鼠在不同阶段出现较为显著的气道高反应^[2]，追根溯源，MP本身亦是构成气道高反应性的关键因素之一。MPP相关的肺损伤被认为主要与全身免疫反应密切相关^[13-14]，细胞介导的免疫反应在MPP感染中起重要作用。TOLL样受体（TLRs）与机体免疫有关^[15]，是目前发现的具有启动天然免疫和获得性免疫的古老模式识别受体，其中TLR4是TLRs家族的重要亚型之一。有研究表明，TLR4在MP致病机制中发挥重要作用^[16]，并可通过IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子的表达水平影响病程进展。同时MyD88作为TLR结构域的接头蛋白，使大部分TLRs通过其介导下游信号转导，从而引起相关疾病^[17]。其作为中间载体，可与NF-κB相结合，进一步激发下游信号分子的活化，介导炎症反应。

目前MPP的发病机制中，炎症损伤在免疫损伤中占重要地位^[18]。MPP所致的炎性损伤主要是通过黏附及细胞毒效应对呼吸道上皮造成直接损伤和通过免疫机制引起呼吸道及肺外系统损伤。MP可激活免疫系统，产生多种细胞因子和其他体液因子，TLR4/MyD88/NF-κB信号传导通路及下游炎性因子参与了这一过程，IL-6、IL-8、TNF-α等作为下游炎性因子在MP感染发生、发展病理过程中扮演了重要角色^[19]。越来越多的证据表明^[20]，其感染引起的组织损伤能够通过诱导先天免疫反应，激活TLR4，并介导下游信号传递分子MyD88进行胞内信号转导，使NF-κB移位到细胞核，启动TNF-α IL-6等炎性细胞因子的转录，级联式放大炎症反应。其中IL-6、IL-8、TNF-α等的释放，在MPP的发病及进展中起重要作用^[21]。

已有研究证明感染MP后，TLR4/NF-κB信号通路被激活，由此推测TLR4/MyD88/NF-κB信号传导通路是评估支原体感染的一个理想切入点，如今许多专家越来越重视儿童MPP的中医药治疗^[22]，有研究通过系统解析中医药干预支原体肺炎的作用机制发现，中药复方不仅对MPP致病菌株具有靶向抑制效应，还可改善免疫微环境，从而调控免疫功能^[23]。宣肺清络方是天津中医药大学第二附属医院院内经验方，该方基于“络病学”理论，广泛应用于临床。该方先以麻黄、石膏、桑白皮确立清肺化痰之核心治法，再依“多病机兼顾”思路配伍诸药：用桃仁活血祛络瘀，莱菔子、冬瓜子温肺化浊痰，瓜蒌功善行气通络、宽胸散结，金银花、鱼腥草、黄芩共奏清热解毒、通络散结之功，地龙、僵蚕搜风刮络，以宣畅气机滞涩，数法并行，形成“清、化、通、祛”协同的配伍体系。以利肺络通畅，通补荣养，达到通之目的，改善MPP所致的痰热郁闭于肺。前期临床及实验研究已证实宣肺清络方对IL-4、IL-10等细胞炎症因子具有调节作用。本团队基于“络病学”理论，寻找“络”与MPP免疫学机制的交叉结合点，推测宣肺清络方可能是通过减轻或抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路TLR4的激活表达，减少NF-κB活化，减弱其下游炎性因子如IL-6、IL-8、TNF-α等的释放，从而达到减轻炎症及气道损伤，从而起到治疗MPP痉咳的临床作用。

研究结果显示，通过建立MPP痉咳模型发现，与空白组相比，支原体肺炎痉咳组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达水平明显上调，表明在MPP痉咳模型中，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路处于激活状态。在治疗干预后，各治疗组TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6、IL-8、TNF-α的相关表达水平均有所下降，这表明通过调节该信号通路的表达，能够调控呼吸道免疫反应，抑制炎症因子的释放，进而实现对MPP的治疗效果。

综上所述，宣肺清络方可通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，抑制由MPP引起的炎性损伤，可能是其治疗支原体肺炎痉咳的机制之一。本课题组基于前期临床基础，试图阐述MPP痉咳机制，为今后减少大环内酯类药物提供新思路。