2026, Vol. 43文章信息
- 张晓娟, 刘沙沙, 刘影, 等.
- ZHANG Xiaojuan, LIU Shasha, LIU Ying, et al.
- 基于GAS6/Axl通路探讨茯苓酸预处理对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的影响
- Exploring the effect of pachymic acid pretreatment on hydrogen peroxide-induced cardiomyocyte damage based on the GAS6/Axl pathway
- 天津中医药, 2026, 43(8): 1009-1016
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(8): 1009-1016
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.08.09
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文章历史
- 收稿日期: 2026-02-25
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2. 保定市第一中心医院心血管内五科，保定 071000;
3. 河北省第八人民医院中西医结合科，石家庄 050000
过氧化氢（H2O2）暴露常用于构建细胞氧化损伤/应激模型[1]。H2O2通过与细胞内二价铁离子作用产生羟基自由基，是引发炎症反应的有效刺激因子[1]。既往研究表明，H2O2可以诱导心肌细胞H9c2的炎症和细胞凋亡[2-3]。心肌缺血再灌注（IR）损伤，是指冠状动脉在缺血基础上，因血流恢复而直接引发的心肌损伤加剧现象，此为溶栓与经皮冠状动脉介入治疗的主要并发症[4]。在IR这一过程中，H2O2是产物，同时其诱导过度产生有毒的超氧阴离子和羟自由基，又是进一步放大炎症信号通路并诱导细胞凋亡的主要原因[5]。研究证实，H2O2的清除有助于心功能改善[6]。但目前用于临床治疗IR的药物效果却并不理想[6]。因此，迫切需要开发有效新型特效药以缓解患者病情。
茯苓（Polyporaceae）是一种腐生真菌，生长在多种松树中。茯苓酸是一种从茯苓中提取的三萜类化合物，具有抗炎和抗凋亡等生物活性，被广泛应用于癌症、肥胖、心血管相关疾病的治疗[7]。Pang等[8]研究显示，茯苓酸通过减少神经元损伤以及细胞萎缩，对脑缺血/再灌注损伤表现出神经保护作用。Jiang等[9]发现，茯苓酸通过上调谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）表达，抑制体内缺血再灌注诱导的急性肾损伤。这些研究表明茯苓酸具有治疗IR潜力。生长停滞特异性蛋白6/酪氨酸蛋白激酶受体（GAS6/Axl）信号通路的激活是介导心脏保护效应的核心分子机制之一，其通过负向调控H2O2诱导心肌细胞的氧化应激与凋亡，在维持心肌细胞存活与功能完整性中发挥重要作用[10-11]。本研究通过探究茯苓酸对GAS6/Axl通路的影响，阐明其减轻H2O2诱诱导心肌细胞损伤的机制，以期为缺血/再灌注损伤等心血管疾病的治疗寻求新治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 动物大鼠心肌细胞系H9c2、DMEM培养基（含10%FBS）购自南京科佰生物科技有限公司（货号：CBP0064、#CBP60588M）；1%青霉素和链霉素购于赛默飞世尔科技公司（货号：100 U/mL，#15140；100 mg/mL，#15142）；茯苓酸购于四川精萃天成药物科技有限公司（纯度：95%~99%，货号：29070-92-6）；Axl特异性抑制剂R428购于MedChemExpress公司（纯度：99.92%，货号：HY-15150）；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、活性氧（ROS）检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所（货号：C0037，S0033S）；超氧化物歧化酶（SOD）、GSH-Px、丙二醛（MDA）检测试剂盒分别购于南京建成生物工程研究所（货号：A001-3-2、A005-1-2、A003-1-2）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于Roche Diagnostics（货号：11684795910）；RIPA裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay Lysis Buffer）、BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白浓度测定试剂盒分别购于碧云天生物技术研究所（货号：P0013B、P0009）；GAS6、Axl、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、BCL2相关X蛋白（Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase-3）、β-肌动蛋白（β-actin）一抗均购自美国Abcam公司（货号：ab168370、ab89224、ab182858、ab32503、ab32042、ab32351、ab8227）；p-Axl一抗购自于江苏亲科生物研究中心有限公司（货号：AF8523）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的相应二抗（山羊抗兔IgG）购自Abcam（货号：ab6721）。
1.2 试剂 1.2.1 药物浓度筛选将对数生长期的H9c2细胞，按照密度为5×104个/mL，取100 μL接种于96孔板，使用终浓度为0、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L[12]的茯苓酸处理H9c2细胞24 h，然后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃的培养箱中孵育4 h后，用酶标仪在450 nm处测量吸光度，计算细胞活力。
使用同样方法，用不同浓度的茯苓酸预先处理H9c2细胞24 h，再用1 000 μmol/L[5]的H2O2共同培养30 min，检测细胞活力。
1.2.2 细胞处理及分组将H9c2细胞分为对照组（CN组）、H2O2组、茯苓酸低、中、高浓度组（PA-L组、PA-M组、PA-H组）、PA-H+GAS6/Axl通路抑制剂组（PA-H+R428组）。H2O2组用1 000 μmol/L的H2O2处理细胞30 min；PA-L组、PA-M组、PA-H组，分别使用2.5、5.0、10.0 μmol/L的茯苓酸预处理细胞24 h，再用1 000 μmol/L的H2O2共培养30 min；PA-H+R428组使用10 μmol/L的茯苓酸与1 μmol/L[13]的R428共同处理细胞24 h后，再用1 000 μmol/L的H2O2处理细胞30 min，R428处理浓度经查阅文献[13]和前期预实验所得。CN组正常培养细胞，不作任何处理。培养结束后，通过倒置显微镜观察各组H9c2细胞形态。
1.2.3 GSH-Px、SOD、MDA水平检测对各实验组细胞裂解液进行收集后，于4 ℃环境下以12 000 r/min转速离心，离心半径10 cm，收集上清液备用。严格遵循对应试剂盒的操作指南，分别对细胞上清液中SOD、GSH-Px的活性以及MDA的含量展开测定。1.2.4 ROS水平检测通过2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法检测，细胞经指定处理后移除旧培养基，用无血清培养基将探针按1∶1 000稀释（终浓度10 μmol/L），每孔加入适量工作液，37 ℃避光孵育30 min。后续用无血清培养基洗涤细胞3次，再通过荧光显微镜观察成像，或使用荧光酶标仪（激发波长488 nm，发射波长525 nm）检测荧光强度，以此表征细胞内ROS的水平。
1.2.5 细胞凋亡检测采用TUNEL试剂盒检测，将细胞接种于含无菌盖玻片的24孔板上，处理后取出盖玻片用PBS清洗。经4%多聚甲醛室温固定30 min、0.1% Triton X-100冰浴透化5 min后，PBS清洗并加TUNEL反应液，37 ℃湿盒避光孵育1 h。再次清洗后加DAPI染核30 s，封片后高倍镜观察。其中TUNEL阳性核呈绿色、4’，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）标记核呈蓝色，用Image J统计5个随机视野，计算阳性细胞占比即为凋亡率。
1.2.6 Western blot检测GAS6/Axl信号通路及凋亡相关蛋白表达细胞处理后用预冷PBS冲洗，加RIPA裂解液冰浴裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心（离心半径10 cm）15 min取上清。经BCA法测蛋白浓度后，取等量样品行SDS-PAGE电泳，再湿转至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加一抗（按说明书稀释）4 ℃摇床孵育过夜。TBST清洗3次（10 min/次）后，加HRP标记二抗室温孵育2 h。充分清洗后用ECL试剂盒显影，凝胶成像系统采集图像，Image J软件分析条带灰度，以β-actin为内参计算目标蛋白相对表达量。
1.3 统计学分析采用SPSS 26.0软件分析。所有实验独立重复≥3次，数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间数据比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 药物浓度筛选为确定茯苓酸的安全浓度范围及其对H2O2诱导损伤的保护作用，首先进行药物浓度筛选。如图 1A所示，在0~10.00 μmol/L范围内，茯苓酸对正常培养的H9c2细胞无明显毒性作用（P < 0.05）；当茯苓酸浓度达到20.00 μmol/L及以上时，细胞存活率显著下降（P < 0.05）。如图 1B所示，H2O2处理显著降低H9c2细胞存活率（P < 0.05）；而使用2.50 μmol/L及以上浓度的茯苓酸预处理后，H2O2诱导的细胞存活率显著提高（P < 0.05）。故后续实验选用2.50、5.00、10.00 μmol/L分别作为茯苓酸低、中、高浓度（即PA-L、PA-M、PA-H组）进行后续实验。
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| 注：图A，茯苓酸对H9c2细胞毒性的影响；图B，茯苓酸对H2O2诱导的H9c2细胞活力的影响；与0 μmol/L茯苓酸组比较，*P < 0.05；与H2O2组比较，#P < 0.05。 图 1 不同浓度茯苓酸对H2O2诱导H9c2细胞增殖的影响(x±s) Fig. 1 Effect of different concentrations of pachymic acid on H2O2-induced proliferation of H9c2 cells (x±s) |
通过倒置显微镜观察各组H9c2细胞形态（图 2）。CN组细胞形态规则，呈长形，贴壁良好；H2O2组细胞呈现明显损伤，表现为细胞间隙加宽，生长密度低，部分细胞收缩变圆；各茯苓酸处理组（PA-L、PA-M、PA-H）细胞形态改善，损伤程度随浓度升高而减轻，细胞间空隙缩短，其中PA-H组最接近正常组；PA-H+R428组细胞损伤较PA-H组加重，提示R428部分逆转了茯苓酸的保护作用。
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| 图 2 各组细胞不同形态比较（×200） Fig. 2 Comparison of different cell morphology in each group (×200) |
TUNEL染色结果显示（图 3），H2O2组细胞凋亡率显著高于CN组（P < 0.05），而各浓度茯苓酸预处理均能显著抑制H2O2诱导的细胞凋亡（P < 0.05），且呈浓度依赖性。PA-H组凋亡率最低，接近CN组水平，而加入R428后（PA-H+R428组），凋亡率显著回升。
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| 图 3 各组细胞TUNEL染色观察（×200） Fig. 3 TUNEL staining of cells in each group (×200) |
Western blot检测凋亡相关蛋白表达（图 4，表 1）。与CN相比，H2O2组Bcl-2/Bax比值显著降低，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值显著升高（P < 0.05）。茯苓酸预处理可逆转上述趋势，提高Bcl-2/Bax比值，降低Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值，且高浓度组效果最显著。R428干预则显著削弱了茯苓酸的抗凋亡作用。
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| 注：A，CN组；B，H2O2组；C，PA-L组；D，PA-M组；E，PA-H组；F，PA-H+R428组。 图 4 Western blot检测Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3、Capase-3蛋白表达 Fig. 4 Protein expression of Bcl-2, Bax, Cleaved-Caspase-3 and Capase-3 detected by Western blot |
| 组别 | n | 细胞凋亡率(%) | Bcl-2/Bax | Cleaved-Caspase-3/Capase-3 |
| CN组 | 6 | 1.81±0.19 | 1.71±0.29 | 0.34±0.04 |
| H2O2组 | 6 | 32.11±3.46* | 0.13±0.03* | 1.17±0.13* |
| PA-L组 | 6 | 18.42±1.90# | 0.43±0.09# | 0.87±0.09# |
| PA-M组 | 6 | 15.21±1.69#△ | 0.78±0.15#△ | 0.64±0.07#△ |
| PA-H组 | 6 | 8.77±0.91#△▲ | 1.61±0.28#△▲ | 0.39±0.04#△▲ |
| PA-H+R428组 | 6 | 16.21±1.73& | 0.69±0.13& | 1.04±0.11& |
| 注：与CN组比较，*P < 0.05；与H2O2组比较，#P < 0.05；与PA-L组比较 |
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通过检测SOD、GSH-Px、MDA及ROS水平评估H9c2细胞氧化应激状态（表 2，图 5）。与CN组相比，H2O2组SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA含量及ROS水平显著升高（P < 0.05）。与H2O2组相比，茯苓酸预处理可显著提高H9c2细胞SOD、GSH-Px活性，降低MDA及ROS水平，且呈浓度依赖性。PA-H组各项指标接近CN组水平。而PA-H+R428组上述保护作用被明显逆转（P < 0.05）。
| 组别 | n | SOD(U/mL) | GSH-Px(U/mL) | MDA(U/mL) | ROS相对水平 |
| CN组 | 6 | 128.20±13.11 | 174.35±18.22 | 4.92±0.51 | 2.38±0.24 |
| H2O2组 | 6 | 40.26± 4.87* | 66.71± 6.69* | 14.31±1.53* | 8.67±0.89* |
| PA-L组 | 6 | 60.25± 5.84# | 98.93± 9.91# | 11.34±1.20# | 6.11±0.70# |
| PA-M组 | 6 | 84.33± 8.52#△ | 127.21±12.81#△ | 8.85±0.89#△ | 4.33±0.43#△ |
| PA-H组 | 6 | 113.37±12.47#△▲ | 152.28±15.16#△▲ | 5.26±0.53#△▲ | 2.75±0.28#△▲ |
| PA-H+R428组 | 6 | 77.81± 7.93& | 105.14±10.42& | 9.78±0.99& | 5.59±0.56& |
| 注：与CN组比较，*P < 0.05；与H2O2组比较，#P < 0.05；与PA-L组比较，△P < 0.05；与PA-M组比较，▲P < 0.05；与PA-H组比较，&P < 0.05。 | |||||
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| 图 5 DCFH-DA荧光探针法检测细胞ROS（×100） Fig. 5 Detection of ROS in cells by DCFH-DA fluorescence probe (×100) |
Western blot检测GAS6、Axl及p-Axl蛋白表达（图 6，表 3）。与CN组相比，H2O2组中，GAS6/β-actin及p-Axl/Axl比值均显著降低（P < 0.05）。与H2O2组相比，茯苓酸预处理可显著上调GAS6表达及Axl磷酸化水平，且呈浓度依赖性。PA-H组上述指标接近CN组水平。而在PA-H+R428组中，GAS6/Axl通路蛋白表达被显著抑制（P < 0.05），提示R428阻断了茯苓酸对该通路的激活作用。
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| 注：A，CN组；B，H2O2组；C，PA-L组；D，PA-M组；E，PA-H组；F，PA-H+R428组 图 6 Western blot检测GAS6/Axl通路蛋白表达 Fig. 6 Western blot analysis of GAS6/Axl pathway protein expression |
| 组别 | n | GAS6/β-actin | p-Axl/Axl |
| CN组 | 6 | 1.05±0.01 | 0.81±0.09 |
| H2O2组 | 6 | 0.29±0.03* | 0.21±0.03* |
| PA-L组 | 6 | 0.41±0.04# | 0.36±0.04# |
| PA-M组 | 6 | 0.66±0.07#△ | 0.63±0.06#△ |
| PA-H组 | 6 | 0.92±0.09#△▲ | 0.79±0.09#△▲ |
| PA-H+R428组 | 6 | 0.51±0.06& | 0.57±0.06& |
| 注：与CN组比较，*P < 0.05；与H2O2组比较，#P < 0.05；与PA-L组比较△P < 0.05；与PA-M组比较，▲P < 0.05；与PA-H组比较，&P < 0.05。 | |||
心肌缺血再灌注损伤（IR）、心力衰竭等心脏疾病的发生与发展，与氧化应激诱导的心肌细胞凋亡密切相关[14]。H2O2作为一种稳定的活性氧，被广泛应用于建立心肌细胞氧化损伤模型[10]。本研究通过H2O2处理H9c2细胞成功模拟了心肌细胞氧化损伤，并确认了2.5~10 μmol/L茯苓酸在对H9c2细胞无毒性的情况下，能显著拮抗H2O2诱导的细胞活力下降，为后续实验提供安全浓度依据。本研究从GAS6/Axl信号通路的角度，探讨了中药活性成分茯苓酸对心肌细胞的保护作用及潜在机制。
细胞凋亡是过量ROS诱导半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶失活，导致心肌细胞死亡的主要方式之一[15]。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2蛋白家族中最重要的成员之一，两者功能相互拮抗，其“比例”共同决定细胞的命运[15]。Bcl-2/Bax作为调控开关，启动下游的细胞凋亡核心调控者Caspase-3，而Cleaved-Caspase-3作为被激活的执行者，是细胞凋亡发生的明确标志[16]。在先前研究中，Zhao等[17]经体外研究发现，H2O2诱导的心肌IR损伤导致细胞凋亡发生，并显著增加Caspase-3、Bax表达，降低Bcl-2表达。然而，中药活性成分芒果苷有效地改善心肌细胞凋亡。Liang等[10]研究发现，H2O2诱导的小鼠心肌细胞氧化应激损伤，诱导ROS增加、下调Bcl-2/Bax水平，导致细胞活力降低，细胞凋亡率升高。本研究结果表明，H2O2处理可显著上调促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，导致Bcl-2/Bax比值降低，细胞凋亡率显著升高。而茯苓酸预处理能够以浓度依赖的方式逆转上述蛋白表达的变化，有效抑制细胞凋亡。这与Pang等[8]研究结果类似，茯苓酸通过下调Cleaved Caspase蛋白表达，防止大鼠脑I/R损伤。Liu等[18]研究发现茯苓酸预处理降低Bax表达并增加Bcl-2表达，降低细胞凋亡，缓解了失血性休克后导致的心脏损伤。以上结果表明，茯苓酸在H2O2诱导的大鼠心肌细胞损伤过程中，有效发挥抗凋亡作用。
氧化应激作为引发凋亡的上游信号，诱导体内ROS的产生超过机体清除能力，导致氧化与抗氧化系统失衡，进而引发细胞损伤和凋亡的病理过程[19]。Liu等[20]研究发现，20 μg/mL茯苓酸降低了通过氧-葡萄糖剥夺和再灌注（OGD/R）诱导的小鼠心肌细胞MDA和ROS的产生，增加GSH-Px活性，减轻小鼠心肌IR损伤。Yin等[19]研究显示，PA可以显著缓解缺氧/复氧引起的H9c2细胞损伤，有效逆转MDA、SOD和ROS等氧化应激指标的异常。本研究发现H2O2诱处理后，细胞内保护性抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性显著降低，而脂质过氧化产物MDA和活性氧ROS水平则急剧升高。茯苓酸处理则能显著提升SOD和GSH-Px的的活性，有效清除过量的ROS，减轻脂质过氧化损伤。这表明，茯苓酸通过增强细胞的抗氧化防御能力，减轻H2O2引发的氧化应激，发挥强抗氧化应激效应。
Axl是TAM（Tyro3、Axl和Mertk）酪氨酸激酶受体家族的成员，是血管重塑的重要调节因子。GAS6是一种维生素K依赖性分泌蛋白，GAS6通过与Axl受体结合发挥保护作用，增加细胞存活和增殖[21]。Gas6/Axl通路已被证明在多种心血管疾病模型中发挥重要作用。Lu等[21]通过体内实验发现，IR心脏损伤小鼠心肌细胞中GAS6、Axl水平下调，而GAS6过表达显著改善心肌IR损伤小鼠心功能障碍，缓解氧化应激和细胞死亡。类似研究显示，H2O2诱导心肌损伤细胞中GAS6、p-Axl/Axl蛋白水平降低[10]。本实验结果显示，H2O2处理严重抑制GAS6表达和Axl磷酸化激活。而茯苓酸预处理能够以浓度依赖的方式显著上调GAS6蛋白水平和p-Axl/Axl比值，有效激活GAS6/Axl信号通路，这与GAS6过表达效果一致。孟王桃等[11]研究发现R428通过阻断Axl受体的激活，显著降低GAS6蛋白表达、Bcl-2/Bax蛋白表达、p-Axl/Axl比值，逆转大剂量益母草碱对冠心病大鼠心肌损伤的改善作用。与先前实验结果一致，当使用特异性Axl抑制剂R428后，高剂量茯苓酸所展现出的抗凋亡和抗氧化应激保护作用被显著削弱。实验结果有力证明，茯苓酸的保护作用可以通过激活GAS6/Axl信号通路来实现。
综上所述，茯苓酸能够有效减轻H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤和凋亡，其作用机制与激活GAS6/Axl信号通路，进而增强细胞抗氧化能力、调节Bcl-2/Bax平衡及抑制Caspase-3活化密切相关。本研究为茯苓酸作为潜在心脏保护剂提供新的实验证据，也为中医药防治心血管疾病提供了新的理论依据和药物开发靶点。但本研究尚存一定局限性，仅通过抑制剂R428初步佐证GAS6/Axl通路的介导作用，未开展过表达或基因敲除等实验，难以明确通路与药物效应间的直接因果关联。此外，实验仅局限于体外H9c2细胞模型，药物临床应用仍需体内实验与药代动力学数据支撑。
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2. The Fifth Department of Cardiology, Baoding No.1 Central Hospital, Baoding 071000, China;
3. Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The Eighth People's Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050000, China