2026, Vol. 43文章信息
- 刘艳彬, 朱睿, 吴彩军, 等.
- LIU Yanbin, ZHU Rui, WU Caijun, et al.
- 扶正透邪解毒方调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路治疗多重耐药菌感染肺炎的药效与作用机制
- Efficacy and mechanism of action of Fuzheng Touxie Jiedu Prescription in modulating NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathways in rats with pneumonia caused by multi-drug resistant organisms
- 天津中医药, 2026, 43(8): 1017-1027
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(8): 1017-1027
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.08.10
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文章历史
- 收稿日期: 2026-03-30
引用本文 |
2. 清华大学玉泉医院，北京 100040;
3. 北京中医药大学第三附属医院，北京 100029;
4. 北京中医药大学脓毒症研究所，北京 100700
多重耐药菌（MDRO）是指同时对3种或3种以上的抗菌药物耐药的病原菌 [1]。世界卫生组织（WHO）资料显示，中国抗生素的使用率远高于国际上规定的标准，由此加快了临床上耐药菌的形成。2023年中国CHINET多重耐药菌监测结果显示：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出率为29.1%，三代头孢菌素耐药大肠埃希菌（CTX/CRO-R-ECO）和肺炎克雷伯菌（CTX/CRO-R-KPN）的检出率分别为48.9%和27.7%；碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CR-PAE）和鲍曼不动杆菌（CR-ABA）的检出率分别为16.3%和55.5% [2]。多重耐药菌的出现不仅增加抗感染治疗的难度，而且加重患者病情，延长住院时间，增加住院费用。大剂量抗生素的使用还会造成皮肤损害、胃肠系统损害、全身性损害等不同程度的不良反应事件 [3]。
中医药在MDRO感染治疗中具有独特优势。中医药治疗不仅可以减少耐药菌的产生，并且可以改变现有耐药菌或泛耐药菌的耐药性，降低多重感染发生的几率。多重耐药菌感染肺炎归属于“风温肺热病”范畴，以“正虚邪（毒）伏”为主要病机，治则当以扶正补虚兼以祛邪解毒为主 [4]。扶正透邪解毒方（黄芪、当归、丹参、玄参、大黄、金银花）化裁自“四妙勇安汤”和“当归补血汤”，遵扶正、透邪、解毒治法立方。前期临床应用证实该方联合常规治疗能有效改善耐药菌肺炎脓毒症患者的临床症状，下调炎症指标，改善凝血功能异常等 [5]，但其具体作用机制尚未完全明确。本研究采用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（LC-Q-TOF-MS）、网络药理学、分子对接联合动物实验探讨扶正透邪解毒方治疗多重耐药菌感染肺炎的作用机制，以求为扶正透邪解毒方治疗多重耐药菌感染肺炎提供依据，为中西医协同治疗多重耐药菌感染肺炎开拓思路。
1 材料 1.1 试剂ELISA检测试剂盒：白细胞介素（IL）-1β、IL-18、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6（江莱生物，批号分别为JL20884、JL20882、JL13202、JL20896）；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）抗体（Abcam公司，批号：ab263899）；凋亡相关斑点样蛋白（ASC）抗体（Santa公司，批号：sc-514414）；消皮素（GSDMD）抗体（Proteintech公司，批号：20770-1-AP）；GAPDH抗体（Abcam公司，批号：ab181602）；Goat Anti-Rabbit IgG，HRP（Abcam公司，批号：ab6721）；Western Protein Marker I（Servicebio公司，批号：G2086）；Protein Extraction Ki（t GenePool公司，批号：GPP1815）；Milk Blocking Buffer（GenePool公司，批号：GPP1819）；BSA Blocking Buffer（GenePool公司，批号：GPP1818）；SDS-PAGE Gel Kit（GenePool公司，批号：GPP1816）；SDS-PAGE Loading Buffer（5×，GenePool公司，批号：GPP1820）；Tris-Glycine Running Buffer（5×，GenePool公司，批号：GPP1821）；Western blot Transfer Buffer（GenePool公司，批号：GPP1817）；TBST（10×，GenePool公司，批号：GPP1822）；ECL Plus Western blot Kit（pg级，GenePool公司，批号：GPP1824）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120）；苏木素染液（美国博士德生物工程有限公司，批号：AR11800-1）；伊红染色液（美国博士德生物工程有限公司，批号：AR11800-2）；Total RNA Extraction Kit（DNase I，GenePool公司，批号：Cat#GPQ1801）；mRNA cDNA Synthesis Kit（GenePool公司，批号：Cat#GPQ1803）；mRNA/IncRNAqPCRKi（t GenePool公司，批号：Cat#GPQ1808）；RNA Loading Buffer（5 ×，GenePool公司，批号：Cat#GPQ1813）等。
1.2 仪器Nexera X2 system液相色谱仪（日本SHIMADZU公司）；Triple TOF 5 600+高分辨质谱仪（美国AB SCIEX公司）；Analyst TF 1.6，MarkerView 1.2.1数据采集软件（美国AB SCIEX公司）；酶标仪（美国BioTek-ELx800公司）；恒温箱（美国Thermo3111公司）；双垂直电泳槽（CAVOY，MP-8001）；转移槽（CAVOY，MP-3030）；温控摇床（其林贝尔，TS-2000A）；电泳仪（CAVOY，PP-1150）；涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司；QL-902）；离心机（Eppendorf公司，Centrifuge5415D）；分光光度计（Thermo scientific公司，NANODROP 2000）；荧光定量PCR仪（Bioer Technology公司，Line Gene 9600 Plus）等。
1.3 菌液与药物多重耐药铜绿假单胞菌菌株由北京中医药大学东直门医院检验科提供（编号：2010113），该菌株分离自临床诊断为“多重耐药铜绿假单胞菌肺炎”患者呼吸道深部分泌物，经临床实验室鉴定，其对包括第三代头孢菌素、碳青霉烯类、喹诺酮类在内的至少3类抗菌药物耐药，被确认为多重耐药。
扶正透邪解毒方组成：黄芪60 g，当归30 g，金银花30 g，丹参15 g，玄参15 g，大黄6 g，换算成中药全成分免煎颗粒：黄芪24 g（批号：23015711），当归20 g（批号：24000571），丹参7.5 g（批号：23029851），金银花10 g（批号：22040781），玄参10 g（批号：22017841），大黄1.5 g（批号：22000351），均购自北京康仁堂药业有限公司。
注射用哌拉西林他唑巴坦钠（珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，规格：4.5 g/瓶，国药准字号H20054306，批号：24084202）。
1.4 动物SPF级雄性SD大鼠36只，6~8周龄，体质量（220±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证：SYXK（京）2022-0019，饲养于北京实验动物研究中心，动物饲养条件：温度23~25 ℃，湿度50%±10%，光照12 h，自由饮水。本实验经北京实验动物研究中心有限公司动物伦理委员会审批（批号：BLARC-LAWER-202404010）。
2 方法 2.1 LC-Q-TOF-MS检测 2.1.1 含药血清制备随机选取6只大鼠，分为正常组和给药组。给药组予扶正透邪解毒方免煎颗粒14.04 mg（/kg·d）灌胃，正常组予等体积蒸馏水灌胃，1次/d，连续7 d。末次给药2 h后予2.5%三溴乙醇溶液腹腔注射麻醉，腹主动脉取血约3 mL，室温放置1 h，1 500 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，获得含药血清。
2.1.2 样品制备称取200 μL血样，加入400 μL 70%甲醇/30%乙腈浸提4 h。10 000 r/min（离心半径10 cm）离心15 min，取上清600 μL经0.22 μm微孔滤膜过滤，冻干备用。检测前加入200 μL甲醇/水溶剂复溶后检测。
2.1.2 色谱条件安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），柱温35 ℃，进样量3 μL，流速0.5 mL/min，流动相A：H2O（0.1%甲酸），流动相B：乙腈（0.1%甲酸），梯度洗脱条件见表 1。
| 时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0.0 | 98 | 2 |
| 1.0 | 98 | 2 |
| 13.0 | 10 | 90 |
| 16.0 | 10 | 90 |
| 16.1 | 98 | 2 |
| 20.0 | 停止 | |
电喷雾电离（ESI）源，正负离子电离模式。离子源温度120 ℃，脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂氮气流600 L/h，锥孔反吹氮气50 L/h。正负离子模式毛细管电压分别为3.0 kV和4.5 kV，取样锥孔电压为27 eV，萃取锥孔4 eV，四极杆扫描范围m/z 50~1 500。
2.1.4 化合物鉴定按上述条件对样品进行检测，采用Analyst TF 1.6，MarkerView 1.2.1软件收集数据，使用MSDIAL3.7.0软件和参考文献进行化合物比对指认。
2.2 网络药理学 2.2.1 扶正透邪解毒方靶点预测与疾病靶点筛选根据扶正透邪解毒方含药血清的活性成分，采用Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch）和HERB数据库（http://herb.ac.cn/）检索，获得活性成分靶点。在GeneCards（http://www.gene-card.org/）、OMIM（https://mirror.omim.org）数据库中，采用“multi-drug resistant organism pneumonia”“multi-drug resistant bacterial pneumonia”“pneumonia infected with multi-drug resistant bacteria”为关键词进行检索，去除重复基因后获得多重耐药菌感染肺炎的相关靶点。
2.2.2 PPI网络构建在Venny2.1.0（https://bioinfogp.csic.es/）平台上分别输入扶正透邪解毒方潜在靶点和多重耐药菌感染肺炎相关靶点，获得扶正透邪解毒方潜在靶点和多重耐药菌感染肺炎相关靶点的交集靶点。将交集靶点输入String平台（https://cn.string-db.org/），以.tsv格式下载PPI互作关系文件，再将文件导入Cytoscape3.10.0软件中，通过CytoNCA网络分析插件，根据Degree、Closeness、Betweenness值获取核心靶点。
2.2.3 GO和KEGG富集分析利用DAVID数据库（https://davidbioinformatics.nih.gov/）将2.2.2获得的交集靶点进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。KEGG通路富集分析根据P < 0.05为标准进行筛选。整理数据后采用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化作图。
2.2.4 分子对接选取2.2.2中核心靶点Degree值前8位的靶点进行分子对接，使用PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载这些核心靶蛋白的3D结构，作为受体；使用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载靶点对应活性成分的2D结构，作为配体。采用CB-Dock2（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php/）在线网站进行分子对接计算结合能。
2.3 动物实验综合网络药理学预测的炎症与免疫相关通路以及NFKB1等核心靶点，结合文献报道中细胞焦亡在细菌性肺炎中的关键作用，本研究选择核因子-κB（NF-κB）下游关键的NLRP3/半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1（Caspase-1）/GSDMD信号通路作为实验验证的切入点。
2.3.1 动物分组、造模与干预将30只大鼠随机分为空白组、模型组、中药组、西药组、中药+西药联合治疗组5组，每组6只。除空白组外，其余各组均采用气管滴注100×3 Mcf多重耐药铜绿假单胞菌菌液构建多重耐药菌感染肺炎大鼠模型。造模后2 h给药。
扶正透邪解毒方免煎颗粒采用生理盐水充分溶解，4 ℃保存；注射用哌拉西林他唑巴坦钠溶于生理盐水配制成浓度为0.11 g/mL的溶液，4 ℃保存。中药组予扶正透邪解毒方免煎颗粒14.04 mg（/kg·d）灌胃；西药组予哌拉西林他唑巴坦钠0.27 g（/kg·d）腹腔注射，中药+西药联合治疗组予中药灌胃和西药腹腔注射；空白组和模型组予等体积蒸馏水灌胃，1次/d，连续7 d。末次给药后2 h予2.5%三溴乙醇溶液腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清，-80 ℃保存；留取右肺下叶，浸泡于4%多聚甲醛组织固定液中，用于HE染色；剪下右肺中叶和上叶，装入微型离心管，-80 ℃保存，用于后续实时荧光定量PCR和Western blot等检测。
2.3.2 检测指标肺组织HE染色：大鼠右肺下叶在4%多聚甲醛固定液中固定24 h后，常规冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、连续4 μm后切片，常规脱蜡、脱水、HE染色、中性树胶封片，显微镜下观察并拍片。
ELISA法检测大鼠血清IL-18、IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平：按照试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠血清IL-18、IL-1β、TNF-α及IL-6的表达水平。
实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1及GSDMD表达水平。取30~50 mg肺组织在液氮中充分研磨后，加入1 mL RLT，反复吹打几次，提取肺组织中总RNA。取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，按产品说明书用mRNA cDNA Synthesis Kit进行反转录，42 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min，反应结束后短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；反转录得到的cDNA放置-20 ℃保存。用荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。引物序列见表 2。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| Casp1 | 上游: CTGGTCTTGTGACTTGGAGGA |
| 下游: TCAGTGGTTGGCATCTGTAGT | |
| ASC | 上游: GCACAGCCAGAACAGAACAT |
| 下游: TGTCCTTCAGTCAGCACATTG | |
| NLRP3 | 上游: AGACCTCCAAGACCACGACTG |
| 下游: CATCCGCAGCCAATGAACAGA | |
| GSDMD | 上游: GCAGTGGTGAGCAGGTAGAG |
| 下游: CCAGAGCCTTAGTAGCCAGTAG | |
| GAPDH | 上游: TGGAGTCTACTGGCGTCTT |
| 下游: TGTCATATTTCTCGTGGTTCA |
Western blot检测大鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平：按照Protein Extraction Kit试剂盒说明书操作，提取大鼠肺组织中的蛋白，用水及SDS-PAGE Loading Buffer调整蛋白浓度，100 ℃煮沸变性10 min。根据目的蛋白的分子量，配制10%的分离胶，5%浓缩胶。稀释一抗，封闭结束后4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗，室温轻摇50 min。TBST洗膜4次，每次5 min，ECL反应，暗室中曝光、显影并定影。采用Quantity One v.4.6.2软件读取条带灰度值。
2.4 统计学方法采用SPSS 27.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布且方差齐，多样本比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 扶正透邪解毒方有效成分数据库构建根据LC-Q-TOF-MS检测结果和比对，共获得扶正透邪解毒方含药血清活性成分34种，主要包括有机酸类、黄酮类、苯丙素类等。见表 3。
| 序号 | 化合物 | 保留时间(min) | 误差(ppm) | 分子式 | 模式 | 实测值(m/z) | 归属 | 分类 |
| 1 | 7-羟基香豆素 | 9.11 | -1.04 | C9H6O3 | [M+H]+ | 163.038 8 | b | 苯丙素类 |
| 2 | 谷氨酸 | 1.53 | -1.35 | C5H9NO4 | [M+H]+ | 148.060 2 | b | 有机酸类 |
| 3 | L-色氨酸 | 4.93 | 2.44 | C11H12N2O2 | [M+H]+ | 205.097 2 | a, b, g | 有机酸类 |
| 4 | L-酪氨酸 | 3.49 | -3.29 | C9H11NO3 | [M+H]+ | 182.081 1 | f | 有机酸类 |
| 5 | 甲硫氨酸 | 2.43 | 2.00 | C5H11NO2S | [M+H]+ | 150.058 0 | a | 有机酸类 |
| 6 | 苯丙氨酸 | 4.38 | 1.20 | C9H11NO2 | [M+H]+ | 166.085 9 | b, f | 有机酸类 |
| 7 | 脯氨酸 | 1.64 | 3.45 | C5H9NO2 | [M+H]+ | 116.070 2 | a, f | 有机酸类 |
| 8 | 对羟基肉桂酸 | 3.49 | 2.92 | C9H8O3 | [M+H]+ | 165.055 1 | e, g | 酚酸类 |
| 9 | 胆碱 | 11.99 | 4.80 | C5H14NO | [M+H]+ | 104.107 5 | a | 有机酸类 |
| 10 | 肉桂酸 | 4.37 | 1.21 | C9H8O2 | [M+H]+ | 149.059 1 | b | 有机酸类 |
| 11 | 6-甲基香豆素 | 10.68 | 2.82 | C10H8O3 | [M+H]+ | 177.055 1 | b, g | 苯丙素类 |
| 12 | L-精氨酸 | 3.90 | 4.57 | C6H14N4O2 | [M+H]+ | 175.119 9 | a, b, g | 有机酸类 |
| 13 | Salvianono | 13.45 | 4.98 | C18H20O4 | [M+H]+ | 301.145 0 | c | 酚酸类 |
| 14 | 油酸 | 16.11 | -1.42 | C18H34O2 | [M-H]- | 281.248 2 | a | 有机酸类 |
| 15 | 亚油酸 | 15.16 | 0.86 | C18H32O2 | [M-H]- | 279.233 2 | a, b | 有机酸类 |
| 16 | 肉豆蔻酸 | 14.72 | 2.24 | C14H28O2 | [M-H]- | 227.201 2 | b | 有机酸类 |
| 17 | 棕榈酸 | 15.93 | 3.53 | C16H32O2 | [M-H]- | 255.233 8 | c | 有机酸类 |
| 18 | 亚麻酸 | 14.49 | 3.97 | C18H30O2 | [M-H]- | 277.216 2 | a, b, g | 有机酸类 |
| 19 | 杜鹃花酸 | 7.13 | 0.53 | C9H16O4 | [M-H]- | 187.097 7 | a, b, g | 有机酸类 |
| 20 | 柠檬酸 | 1.84 | 3.14 | C6H8O7 | [M-H]- | 191.019 1 | a | 有机酸类 |
| 21 | 癸二酸 | 7.83 | 3.08 | C10H18O4 | [M-H]- | 201.113 9 | b | 有机酸类 |
| 22 | L-焦谷氨酸 | 2.29 | 3.91 | C5H7NO3 | [M-H]- | 128.035 1 | a | 有机酸类 |
| 23 | 对羟基苄基丙二酸 | 6.25 | 0.48 | C10H10O5 | [M-H]- | 209.046 3 | g | 有机酸类 |
| 24 | 泛酸 | 4.50 | -0.92 | C9H17NO5 | [M-H]- | 218.103 2 | b | 有机酸类 |
| 25 | 尿苷 | 1.69 | 2.47 | C9H12N2O6 | [M-H]- | 243.060 6 | g | 核苷类 |
| 26 | 甘草苷 | 6.73 | -1.20 | C21H22O9 | [M-H]- | 417.118 6 | g | 黄酮类 |
| 27 | 葡萄糖全苷 | 8.99 | 0.00 | C22H20O11 | [M-H]- | 459.093 3 | a, f | 黄酮类 |
| 28 | 原儿茶醛 | 7.70 | -2.26 | C7H6O3 | [M-H]- | 137.024 1 | c, e, f | 有机酸类 |
| 29 | 毛蕊异黄酮苷 | 8.70 | 2.92 | C22H22O10 | [M-H]- | 445.153 0 | a, f | 黄酮类 |
| 30 | 槲皮素 | 7.66 | 5.98 | C15H10O7 | [M-H]- | 301.037 2 | a, d | 黄酮类 |
| 31 | 京尼平苷酸 | 5.22 | -1.87 | C16H22O10 | [M-H]- | 373.113 3 | b | 环烯醚萜苷类 |
| 32 | 芒柄花苷 | 7.58 | 6.95 | C22H22O9 | [M-H]- | 475.121 3 | a, g | 黄酮类 |
| 33 | 苹果酸 | 1.78 | -0.75 | C4H6O5 | [M-H]- | 133.014 1 | b | 有机酸类 |
| 34 | 邻苯二甲酸 | 5.73 | -0.55 | C8H6O4 | [M-H]- | 165.019 3 | b | 有机酸类 |
| 注：a，黄芪；b，当归；c，丹参；d，玄参；e，金银花；f，大黄；g，甘草。 | ||||||||
根据中药有效成分获得538个靶点，在GeneCards数据库和OMIM数据库检索多重耐药菌感染肺炎，去重后共获得1 433个相关靶点。将两者一起输入Venny2.1.0中取交集后获得176个交集靶点。
3.3 核心靶点获取和PPI网络构建将176个交集靶点导入String数据库中，获得PPI网络和相应的. tsv格式文件，将文件导入Cytoscape 3.10.0软件中，根据Closeness > 0.002881727842833184，Betweenness > 180.1022727272713，Degree > 29.704545454545453筛选后获得NFKB1、TNF、IL6、AKT1等38个核心靶点（图 1）。
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| 图 1 扶正透邪解毒方治疗多重耐药菌感染肺炎的核心靶点网络图 Fig. 1 Core targets network diagram of Fuzheng Touxie Jiedu Prescription for the treatment of pneumonia caused by multi-drug resistant organisms |
将176个交集靶点导入DAVID数据库中，进行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析获得1 018条目，其中BP 704条，CC 104条，MF 210条。结果显示BP为靶点最显著富集的方向，核心涉及“对脂多糖的应答”“表皮生长因子受体信号通路”“炎症反应调控”等过程，CC主要涉及“质膜外侧”“转录调节复合物”等组分，MF核心富集“转化生长因子-β（TGF-β）受体活性”“蛋白激酶活性”等功能，这些分子功能可参与感染后肺组织的炎症修复、信号通路传导。提示扶正透邪解毒方主要通过调控耐药菌致病物质应答、炎症信号通路等生物过程，结合对应分子功能发挥治疗耐药菌肺炎的作用。KEGG通路富集分析共获得162条通路，以P < 0.05为标准筛选，选取前10条绘制KEGG通路富集分析气泡图（图 2）。结果显示，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、叉头框O（FoxO）等信号通路显著富集，提示这些通路可能是扶正透邪解毒方靶点的潜在作用方向。
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| 图 2 KEGG通路富集分析气泡图 Fig. 2 Bubble plot KEGG pathway enrichment analysis |
使用CB-Dock2在线网站进行分子对接，结果显示，除表皮生长因子（EGFR）与甲硫氨酸外，其他结合均≤-5.0 kcal/mo（l 1 cal=4.19 J），表明核心靶点与活性成分之间结合活性较好。见表 4。
| 核心靶点 | 活性成分 | 结合能(kcal/mol) |
| NFKB1 | 7-羟基香豆素 | -5.3 |
| EGFR | 槲皮素 | -8.0 |
| EGFR | Salvianono | -6.9 |
| EGFR | 6-甲基香豆素 | -5.6 |
| EGFR | 肉桂酸 | -5.9 |
| EGFR | 苯丙氨酸 | -5.8 |
| EGFR | 甲硫氨酸 | -3.7 |
| EGFR | L-酪氨酸 | -6.0 |
| EGFR | 7-羟基香豆素 | -5.8 |
| AKT1 | 槲皮素 | -9.4 |
| AKT1 | 7-羟基香豆素 | -7.0 |
| TNF | 葡萄糖全苷 | -8.0 |
| TNF | 芒柄花苷 | -8.3 |
| ESR1 | 槲皮素 | -7.7 |
| ESR1 | 甘草苷 | -8.8 |
| ESR1 | 亚麻酸 | -6.8 |
| ESR1 | 亚油酸 | -7.1 |
| ESR1 | Salvianono | -6.6 |
| ESR1 | 7-羟基香豆素 | -6.8 |
| IL6 | 亚麻酸 | -5.8 |
| IL6 | 亚油酸 | -5.4 |
| SRC | Salvianono | -6.2 |
| SRC | 6-甲基香豆素 | -6.3 |
| SRC | 槲皮素 | -8.6 |
| SRC | 芒柄花苷 | -8.4 |
| MAPK3 | 亚油酸 | -5.9 |
| MAPK3 | 油酸 | -6.0 |
空白组大鼠肺泡结构清晰完整，肺泡壁薄且均匀分布，无充血或水肿，未见炎症细胞浸润；模型组大鼠肺组织见大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚，部分断裂，肺泡融合形成肺气肿样改变；与模型组相比，中药组大鼠肺组织炎症细胞浸润减少，肺泡结构破坏减轻，但仍有局部肺泡壁增厚；西药组大鼠肺组织炎症细胞浸润减少，肺泡结构轻度恢复，但仍有轻度气肿样改变；中药+西药联合治疗组大鼠肺组织炎性细胞浸润明显减少，肺泡间隔均匀，无明显断裂或融合。见图 3。
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| 图 3 大鼠肺组织病理情况（HE染色，×20） Fig. 3 Pathological findings of rat lung tissues (HE staining, ×20) |
与空白组相比，模型组大鼠血清IL-18、IL-1β、TNF-α、IL-6水平均显著升高（P < 0.01）；与模型组相比，中药组、西药组和中药+西药联合治疗组干预后4种炎症因子水平均降低，其中中药+西药联合治疗组比中药组、西药组更低，且与模型组的差异更显著（P < 0.05或P < 0.01）。见表 5。
| pg/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | IL-18 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | |||||||||||||||||||||||||
| 空白组 | 55.49±11.54 | 21.10± 6.25 | 24.59± 5.45 | 55.99±17.86 | |||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 271.52±49.40** | 122.87±38.09** | 130.80±25.36** | 318.67±68.15** | |||||||||||||||||||||||||
| 中药组 | 180.46±34.53**# | 84.66±26.78* | 87.48±14.64**# | 212.17±51.62** | |||||||||||||||||||||||||
| 西药组 | 180.26±28.68**# | 58.79±19.84** | 87.85±13.99**# | 212.09±52.46** | |||||||||||||||||||||||||
| 中药+西药联合治疗组 | 127.24±24.17**## | 74.58±41.64*# | 60.88±11.77**# | 151.16±32.99**## | |||||||||||||||||||||||||
| 注：与空白组相比，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
空白组比较，模型组大鼠肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表达水平均显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，中药组、西药组和中药+西药联合治疗组大鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表达水平均显著下调（P < 0.01），其中中药+西药联合治疗组降低幅度最大。见图 4。
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| 注：A，空白组；B，模型组；C，中药组；D，西药组；E，中药+西药联合治疗组；**P < 0.01。 图 4 大鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表达水平（x±s） Fig. 4 Expression levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, and GSDMD mRNA in rat lung tissues (x±s) |
与空白组比较，模型组大鼠肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平均显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，中药组、西药组和中药+西药联合治疗组大鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平均显著降低（P < 0.05或P < 0.01），其中中药+西药联合治疗组降低幅度最大。见图 5。
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| 注：A，空白组；B，模型组；C，中药组；D，西药组；E，中药+西药联合治疗组；*P < 0.05，**P < 0.01。 图 5 大鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平（x±s） Fig. 5 Expression levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, and GSDMD protein in rat lung tissues (x±s) |
多重耐药菌感染肺炎的临床治疗难度大，不仅限制抗菌药物的选择，且极易引发多器官功能障碍和脓毒症 [6-7]，多重耐药菌感染患者的病死率是非多重耐药菌感染患者的3倍以上 [8]，寻求提高多重耐药菌感染肺炎临床疗效的方法，降低患者病死率，这是亟须解决的关键问题。传统中医药在感染性发热疾病的治疗中已积累了丰富的临证经验，现代研究亦证实中医药治疗多重耐药菌感染优势显著 [9-10]。多重耐药菌感染肺炎目前多被归属于“风温肺热病”范畴，其病位在肺，累及脾、胃、心、大肠等脏腑，正虚邪（毒）伏是其关键病机 [4]，如清代医家刘吉人《伏邪新书》记载：“感六淫而不即病，过后方发者总谓之曰邪、伏邪，已发之而治不得法，病情隐伏，亦谓之曰伏邪；有初感治不得法，正气内伤，邪气内陷，暂时假愈，后仍复作者谓之伏邪；有已发治愈，而未能尽除病根，遗邪内伏后又复发亦谓之伏邪。”多重耐药菌感染肺炎为虚实夹杂之证，与现在临床常见多重耐药菌感染肺炎患者多为年老体弱，基础病多，机体免疫力低，易感外邪，病程缠绵的特点相似 [11]。多重耐药菌感染肺炎病起外邪乘虚入内，邪气伤正，正气更虚，正虚为多重耐药菌感染肺炎发生发展的基础，扶正应贯穿治疗始终，如《景岳全书·发热三朝治款》言：“吴东园曰，初热时，只有二事，惟去邪扶正而已，邪热盛则去邪而正气自旺，正气衰则扶正而邪热自退。”正气虚损，脏腑功能失调，气血津液生化失常，无以驱邪外出，邪气深伏于内，治之当透邪外达；毒，病邪之甚也。邪气久留，蕴酿成毒，毒邪内侵，以致病情缠绵不愈，病情危重，解毒为治疗关键。
扶正透邪解毒方化裁自“当归补血汤”和“四妙勇安汤”，由笔者团队参照前人学术经验，结合前期研究成果，在“扶正透邪法”治疗多耐药菌感染基础上优化而成。方中黄芪为君药，升阳气，补中气，具补虚扶正，驱邪外出之功；金银花为臣药，功主透邪外达，透血分热邪转出气分；当归补血活血，且兼止咳平喘之效，丹参、玄参清热凉血活血，养护阴液；大黄荡涤热结，合而清解毒邪。全方攻补兼施，以达到扶正而不留邪，祛邪而不伤正之效。前期临床应用证实，扶正透邪解毒方可改善细菌性肺炎脓毒症患者的临床症状和生存率。基础研究证实扶正透邪解毒方可下调耐药菌感染肺炎大鼠血清相关炎性因子表达，抑制炎症反应，调节免疫平衡 [12-15]。
细胞焦亡是一种依赖于Caspase-1活性的消皮素蛋白介导的细胞凋亡过程，在细胞凋亡过程中，炎症小体NLRP3的活化起着至关重要的作用。NLRP3炎症小体由3部分组成：NLRP3作为受体蛋白、ASC作为接头蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶的前体Pro-Caspase-1为效应蛋白 [16]。NLRP3炎症小体的激活需要经过启动和激活两个关键的环节。在启动的过程中，NLRP3被脂多糖（LPS）、三磷酸腺苷（ATP）、尿酸结晶、尼日尼亚菌素等刺激后，Toll样受体（TLRs）等识别细胞因子激活NF-κB信号通路，引起NLRP3、IL-1β前体和IL-18前体上调；激活所需的信号来源于各类病原相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs），它们会启动多项上游信号转导进程，包括钾外流、钙内流增加、氯外排、线粒体活性氧生成、氧化线粒体DNA释放，以及溶酶体损伤、高尔基解体等。NLRP3被激活后，会募集ASC，从而导致Caspase-1前体募集和激活，寡聚形成大分子的炎症小体复合体。活化的炎症小体不仅促进IL-1β和IL-18的成熟，还可通过裂解其效应蛋白GSDMD诱导细胞焦亡 [17-18]。NLRP3炎症小体是引发炎症和免疫反应的关键因素，NLRP3激活失调会引起炎症反应和自身免疫反应紊乱 [19]。NLRP3炎症小体能识别广泛的刺激，包括各种真菌、细菌和病毒。NLRP3炎性小体广泛参与细菌性感染性肺炎的发生、发展 [20-23]。
LC-Q-TOF-MS和网络药理学结果显示，扶正透邪解毒方的关键成分主要有7-羟基香豆素、槲皮素、甘草苷、芒柄花苷、亚麻酸、亚油酸等，核心靶点包括NFKB1、IL6、TNF等。研究显示，草海桐叶的提取物（包括7-羟基香豆素、亚麻酸、亚油酸等）对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌具有抑制作用 [24]。7-羟基香豆素通过抑制中性粒细胞的超氧阴离子生成和颗粒酶释放，减少炎症反应，而香豆素类衍生物可通过抑制NF-κB p65核转位和p38 MAPK磷酸化，减少TNF-α、IL-1β释放，改善肺组织损伤 [25-26]。亚麻酸可抑制辅助性T细胞17（Th17）分化，减少IL-17A等促炎因子分泌，间接下调IL-6表达 [27]。芒柄花苷能够通过抑制TNF-α抑制炎症和氧化应激 [28]。GO和KEGG富集分析结果亦显示扶正透邪解毒方可调控PI3K-Akt、MAPK等多条炎症免疫相关通路及NF-κB、TNF、IL-6等核心靶点，提示扶正透邪解毒方治疗多重耐药菌感染肺炎可能与调节炎症和免疫反应相关，且这些预测结果与后续实验验证的NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路在分析机制上存在紧密的上下游联系。NLRP3炎症小体的激活需要“启动信号”和“激活信号”的协同作用，作为核心靶点之一的NF-κB是“启动信号”的核心介导者，可通过上调NLRP3、pro-IL-1β等基因的转录为炎症小体激活奠定基础；PI3K-Akt、MAPK通路则可通过调控活性氧生成、蛋白磷酸化等参与“激活信号”的传导，共同促进NLRP3炎症小体活化 [29-30]。基于此，本研究聚焦该通路开展验证。HE染色结果显示，中药组及中药+西药联合治疗组干预可改善肺部炎症损伤。进一步的分子研究证实，扶正透邪解毒方可显著下调大鼠血清IL-1β、IL-18等促炎因子表达水平，改善NLRP3、ASC、GSDMD和Caspase-1 mRNA和蛋白的表达水平，发挥抑制炎症反应和改善免疫紊乱的作用，最终减轻肺组织损伤。
综上所述，本研究以LC-Q-TOF-MS联合网络药理学为基础，结合动物实验验证，证实扶正透邪解毒方多种活性成分入血后，通过多靶点协同作用，抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路的异常启动与活化，从而调节多重耐药菌感染肺炎大鼠机体炎症和免疫反应失衡，减轻肺组织损伤。上述研究结果为扶正透邪解毒方后续的临床应用提供一定的实验基础。
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2. Yuquan Hospital, Tsinghua University, Beijing 100040, China;
3. The Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
4. Institute of Sepsis, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China