肺动脉高压是一种以肺动脉压力升高和血管阻力增加为特征的疾病，常伴随右心衰竭和高病死率。其发病机制复杂，涉及肺动脉细胞功能障碍、炎症刺激和平滑肌异常增殖等。目前治疗药物（如内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶-5抑制剂）虽有一定效果，但无法根治血管病变以及后续一系列并发症。而手术治疗风险高，难以普及。因此，开发新疗法至关重要。

血管内皮细胞作为血管功能稳定发挥作用的重要一环，可以通过分泌多种生物活性物质参与维持血管稳态。在各种理化因素的刺激下，内皮细胞获得间充质细胞特性，这一过程被定义为内皮-间充质转化（EndoMT）。EndoMT通路会影响肺血管的重构进而促进肺动脉高压的形成，血管内皮细胞通过EndoMT转化为间充质细胞，导致多种细胞通路被激活，促进平滑肌样细胞、成纤维细胞在血管损伤部位的累积，这一过程同时还会产生大量的细胞外基质和胶原沉积，造成肺血管重塑，引起肺动脉高压 ^[1-2]。由于内皮细胞的转化导致内皮屏障功能丧失、完整性遭到破坏，血管通透性增加，不仅会加剧局部炎症反应和损伤，还会影响到凝血功能，增加血栓形成的风险，导致肺血管阻力升高。现阶段对于内皮间充质转化的治疗手段有限，多是通过抑制其信号通路以阻断该过程 ^[2]，这些药物中不乏一些中药活性提取物，研究表明丹参注射液可以调控转化生长因子-β（TGF-β）/Smad信号通路来抑制内皮-间充质转化 ^[3]。

在肺动脉高压的治疗中，注射间充质干细胞（MSC）是一种新型治疗方法，MSC具有自我复制及高度分化的特性，通过分化为内皮细胞以促进新血管的形成，并通过旁分泌功能产生一些促血管形成物质以构建侧支循环，减小肺血管压力，同时可以发挥自身免疫调节作用，分泌相关细胞因子减缓炎症反应的发生，从而修复损伤的肺血管，改善血管重构，降低肺动脉压力 ^[4]。中医认为肺动脉高压的基本病机可以概括为宗气亏虚、肺气闭阻、气虚血瘀 ^[5]，依据《黄帝内经》“肺朝百脉”理论，肺主一身之气，贯通百脉助心行血。若肺气亏虚，百脉气血运行不畅，瘀阻肺络，致使脉道挛急，气血壅塞，促使本病的发生。补肺活血方在此基础上设立，强调补气与活血的结合，在临床上具有广泛疗效，以补气活血法为主导的中医治疗可以有效改善肺动脉高压患者喘憋乏力的不适症状，提高心肺能力 ^[6]。

近年来，大量研究证实补气活血类中药对干细胞功能具有多方面的改善作用，针对其迁移效果差，归巢效率低，分化不足等瓶颈问题的解决提供帮助。中医认为，干细胞归属“肾精”理论，其更新修复功能属于正气范畴 ^[7]，《素问》记载：“血气不和，百病乃变化而生”“疏其血气，令其调达，而致平和”强调了气血与正气的密切联系。樊飞燕等 ^[8]认为补气活血类中药可以调控血管内皮生长因子、血管生成素等因子以促进血管的再生，并促进干细胞向脑组织迁移，提高归巢率。章腾等 ^[9]则指出补气活血中药可以促进NSCs、MSCs、ESCs、HSCs、iPSCs等多种干细胞的增殖分化。张睿等 ^[10]指出黄芪可以诱导干细胞向心肌细胞、血管内皮细胞等细胞转化，并通过调控Toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信号通路，来改善炎症导致的细胞损伤。但目前对两者联用增效的分子机制研究单一，缺乏对信号通路、细胞因子协同作用的综合分析，仍需进一步探索。

总体来说，中西医结合疗法在肺动脉高压的治疗中得到了广泛关注和认可，补肺活血方与MSC结合，有望在肺动脉高压治疗中发挥协同作用，但目前多手段联合治疗增效机制尚不明确，这极大限制了新型治疗方案的制定，本研究旨在探讨补肺活血方联合MSC移植通过调节EndoMT在肺动脉高压大鼠模型中的治疗效果及其作用机制。通过动物实验，评估该联合疗法在改善肺动脉高压症状和病理特征、调控EndoMT过程中的效果，揭示其潜在的分子机制，为中西医联合治疗肺动脉高压提供新的理论依据和实验支持。

1 材料与方法 1.1 实验动物

40只6~8周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量（210±10）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。在自由食水，22~25 ℃室内温度、50%~60%相对湿度的条件下标准喂养。本研究经中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会批准（批准编号：IRM-DWLL-2022261），按照国际公认的实验室动物使用和护理原则进行。

1.2 构建低氧性肺动脉高压（HPH）大鼠模型及实验分组

采用常压间断缺氧法，构建HPH大鼠模型，即使舱内氧气浓度维持在10.0%±0.5%，通过放入钠石灰和无水氯化钙吸收舱内二氧化碳和水蒸气，低氧时间设置为每日8 h，持续21 d。按照造模成功率为70%的标准，随机选取34只大鼠进行造模，剩余6只大鼠作为空白组，10只大鼠在造模过程中因低氧死亡，最终24只大鼠造模成功。将造模成功的24只大鼠随机分为4组，每组6只，分别为模型组，模型中药组，模型MSC组，模型中药MSC组。

1.3 实验中药及羊膜间充质干细胞的制备及给药剂量

补肺活血方组成：黄芪20 g，丹参20 g，红花10 g，郁金12 g。所需药物一次性购自天津中医药大学第二附属医院，给药剂量参照《药理实验方法学》中“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算，人（70 kg）与大鼠（200 g）之间系数为0.018，按患者每日需补肺活血方62 g生药计算，200 g大鼠为每日1.12 g生药，即生药5.6 g/kg，按公式：目标浓度（g生药/mL）=每只大鼠所需生药量（g/d）÷拟灌胃体积（mL/d）计算大鼠灌胃药液目标浓度为：2.24 g/mL。所有药材加水煎煮两次，每次时间为30 min，两次煎液用双层纱布滤过后，合并混匀，将合并的药液用小火持续蒸发，将其浓缩成含生药量2.24 g/mL的药液，4 ℃冰箱保存备用。模型中药组、模型中药MSC组大鼠按照2.5 mL/kg给予补肺活血方灌胃，空白组、模型组、模型MSC组按照2.5 mL/kg给予生理盐水灌胃，连续灌胃4周，每日1次。

羊膜间充质干细胞：人羊膜间充质干细胞由吉林省中科生物科技有限公司提供。细胞产品经中国食品药品检定研究院认证（产品报告编号：SH202003882，SH202003883，SH202100043-SH202 100046）。模型MSC组、模型中药MSC组大鼠按照2 mL/kg给予人羊膜间充质干细胞尾静脉注射，空白组、模型组、模型中药组按照2 mL/kg给予生理盐水尾静脉注射，连续注射4周，每周1次。

1.4 主要实验试剂及仪器

主要试剂：血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）抗体（Boster，A02632-2）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（Boster，BM0002）；HRP标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG，H+L，上海碧云天，A0208）；HRP标记山羊抗大鼠IgG（H+L，上海碧云天，A0208）；Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus，上海翊圣生物，11141ES60）；Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix（No Rox，上海翊圣生物，11201ES60）；GAPDH（36 KD）Proteintech 66009-1-I g（1∶5 000稀释）；α-SMA（43 KD）博士德生物BM0002（1∶500稀释）；VE-cadherin（120 KD）博士德生物A02632-2（1∶500稀释）；锌指结构转录抑制因子（Snail，29 KD）博士德生物A00716-2（1∶500稀释）；基质金属蛋白酶9（MMP9，92 KD）Proteintech 10375-2-AP（1∶500稀释）。

主要仪器：显微镜（日本Nikon，E100）；扫描影像系统（深圳生强科技，SQS-40P）；荧光定量PCR仪（美国ABI，Applied Biosystems Stepone plus）。

1.5 标本采集与处理

在对各组大鼠进行灌胃及尾静脉注射4周后，首先采用1.2%异氟烷气体对大鼠进行麻醉，以减少大鼠的应激反应。采血后进行处死并准备相应标本，采用眼球采血法，放入不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4 000 r/min（离心半径5 cm）条件下离心20 min，小心地分离出血清，保存在-20 ℃，用于ELISA检测。处死大鼠后，剖开大鼠胸腔取肺组织，左肺4% 多聚甲醛固定保存，用于HE染色和免疫组织化学法检测，右肺用于qRT-PCR和Western blot检测。处死大鼠后，剖开大鼠胸腔取心脏组织，用于右心室肥厚指数的测定。

1.6 检测指标及方法 1.6.1 右心室肥厚指数

右心室肥厚指数（RVHI）是评价右心室重构的重要指标，与HPH的严重程度呈正相关 ^[11]。将大鼠心脏沿房室沟剪除心房组织，分别剪取右心室（RV）和左心室+室间隔（LV+S），用滤纸吸去血液后称质量，计算RV/（LV+S）比值，即为RVHI。

1.6.2 HE染色

分离大鼠左肺组织，将其用4%多聚甲醛固定24 h，用石蜡包埋组织，随后连续切片，HE染色，在显微镜下，选取直径50~200 μm的肺动脉10根，利用Image Pro Plus6.0图像分析系统观察并测量所选肺动脉的血管总面积、中膜面积、外径及内径。利用下列公式以评估肺血管重塑程度：肺动脉厚度百分比（WT%）=（血管外径-血管内径）/血管外径×100%；肺动脉面积百分比（WA%）=中膜面积/血管面积×100%。以评估肺血管重塑程度。

1.6.3 免疫组织化学法检测肺组织中VE-cadherin、α-SMA蛋白阳性表达情况

蜡块切片，厚度约4 μm，依次脱蜡水化，抗原修复，3%过氧化氢去离子水灭活，3% BSA封闭液封闭30 min，加入适量VE-cadherin（1∶100稀释）、α-SMA（1∶100稀释）一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min。二抗室温孵育50 min，再次PBS冲洗，滴加DAB显色液，苏木素复染细胞核，最后进行梯度脱水，透明，封片。采用ImageViewer软件阅片，结果判定采用免疫组织化学评分（H-score）法。H-score法是将每张切片内阳性细胞比率及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织免疫染色阳性深浅和阳性多少两方面进行综合半定量分析的目的。H-Score ∑（pi×i）=（弱阳性细胞百分比×1）+（中度阳性细胞百分比×2）+（强阳性细胞百分比×3），式中i表示阳性细胞等级划分：阴性无着色，计0分；弱阳性淡黄色，计1分；中度阳性棕黄色，计2分；强阳性棕褐色，计3分。pi表示相应等级的阳性细胞百分比。H-score为0~300分，数值越大说明阳性深浅和阳性多少两方面综合阳性强度越强。

1.6.4 qRT-PCR检测肺组织中VE-cadherin、α-SMA、Snail、MMP9的表达

对收集的肺组织进行匀浆，并使用TRIzol试剂提取总RNA。RNA提取后，通过NanoDrop测定其浓度和纯度，确保质量符合实验要求。使用反转录试剂盒将提取的RNA转录为cDNA，并根据试剂盒说明书进行qPCR反应，通过相对定量方法分析VE-cadherin、α-SMA、Snail、MMP9的表达水平，使用GAPDH作为内参进行标准化处理，数据分析采用2^-ΔΔCt法。以下为引物序列（5’-3’）：大鼠Gapdh上游ACAGCAACAGGGTGGTG GAC；大鼠Gapdh下游TTTGAGGGTGCAGCGAACTT；大鼠VE-cadherin上游CCCGACAGGGAAGACAATG大鼠VE-cadherin下游GCAGGCAAACAGACTTCGG；大鼠α-SMA上游GGCATCATCACCAACTGGGA大鼠α-SMA下游AAGCGTTCATTCCCGATGGT；大鼠Snail上游ATCCTCACTGGCATCTCCCT，大鼠Snail下游CCCTAACAAGTGACGGCCAT；大鼠MMP9上游CTGAGGCCCCTACAGAGTCT；大鼠MMP9下游GTTGTGGAAACTCACACGCC。

1.6.5 Western blot检测肺组织中VE-cadherin、α-SMA、Snail、MMP9的表达

肺组织加入RIPA裂解液，将组织块充分研磨。4 ℃，15 000 r/min（离心半径6 cm）条件下离心10 min，取上清液进行BCA定量，随后进行蛋白电泳。转膜、封闭后，加入稀释后的一抗VE-cadherin（1∶500）、α-SMA（1∶500）、Snail（1∶500）、MMP9（1∶500）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1︰5 000）室温摇床孵育1 h，洗涤后进行化学曝光，使用Image J软件进行分析。

1.6.6 ELISA检测血清中VEGF、TNF-α、IL-6的表达

将血液样本4 000 r/min（离心半径5 cm）条件下离心20 min，分离血清并保存于-20 ℃备用。试剂需提前复温至室温（25 ℃），按1∶20比例稀释洗涤液并按1∶1体积混合底物备用，现配现用。在酶标板中设置标准品梯度（320、160、80、40、20、10 pg/mL）及空白对照孔（仅50 μL样品稀释液），加入样本与标准品后，每孔加入100 μL HRP标记的检测抗体，37 ℃避光孵育60 min。洗板后拍干残留液体，加入底物液并避光37 ℃孵育15 min，随后终止反应并立即使用酶标仪（波长450 nm）读取各孔吸光度（OD值）。通过标准曲线计算样本中TNF-α、VEGF、IL-6浓度，全程需避光并严格控制孵育条件。

1.7 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 26进行数据分析，GraphPad Prism 9软件作图。进行数据的正态性和方差齐性检验，符合条件的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MSC及补肺活血方对大鼠RVHI的影响

各组RVHI的数据分布不符合正态分布，改用Kruskal-Wallis H检验，结果显示各组间比较差异具有统计学意义（H=15.995，P < 0.05）。基于SPSS成对比较功能进行组间两两比较，并采用Bonferroni法进行多重比较校正（以校正后P < 0.05为差异具有统计学意义）。结果显示：与空白组相比，模型组RVHI升高，具有统计学意义（P < 0.05）；与模型组相比，剩余3组RVHI均有所下降，且模型中药MSC组下降幅度最大，模型MSC组次之，模型中药组下降幅度最小，但经统计学分析后，其差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 1。

2.2 MSC及补肺活血方对大鼠WT%和WA%的影响

模型组大鼠WT%和WA%相较空白组明显升高；在模型MSC组、模型中药组、模型中药MSC组分别经过尾静脉注射MSC、补肺活血方灌胃以及两者联用的治疗处理后，3组大鼠的WT%、WA%较模型组均有了不同程度的降低，其中模型中药MSC组的降低最为显著，其次是模型中药组，模型MSC组降低幅度最小（P < 0.05）。见图 2。

2.3 MSC及补肺活血方对大鼠VE-cadherin和α-SMA蛋白表达情况的影响

采用免疫组织化学方法检测，模型组大鼠VE-cadherin的H-score相较于空白组低；在模型MSC组、模型中药组、模型中药MSC组分别经过尾静脉注射MSC、补肺活血方灌胃以及两者联用的治疗处理后，3组大鼠VE-cadherin的H-score较模型组均有了不同程度的升高，其中模型中药MSC组的升高最为显著，其次是模型中药组，模型MSC组升高幅度最小。模型组大鼠α-SMA的H-score相较于空白组高；在模型MSC组、模型中药组、模型中药MSC组分别经过尾静脉注射MSC、补肺活血方灌胃以及两者联用的治疗处理后，3组大鼠α-SMA的H-score较模型组均有不同程度的降低，其中模型中药MSC组的降低最为显著，其次是模型中药组，模型MSC组降低幅度最小（P < 0.05）。见图 3、4、5。

2.4 MSC及补肺活血方对大鼠VE-cadherin、α-SMA、Snail、MMP9基因转录情况的影响

模型组VE-cadherin的mRNA表达情况较空白组降低，而模型中药组、模型MSC组、模型MSC中药组在分别经过尾静脉注射MSC、补肺活血方灌胃以及两者联用的治疗处理后，3组大鼠VE-cadherin的mRNA表达情况较模型组均有了不同程度的升高，其中模型中药MSC组的升高最为显著，其次是模型中药组，模型MSC组升高幅度最小。模型组α-SMA、Snail、MMP9的mRNA表达情况较空白组升高，而模型中药组、模型MSC组、模型MSC中药组在分别经过尾静脉注射MSC、补肺活血方灌胃以及两者联用的治疗处理后，3组大鼠的α-SMA、Snail、MMP9的mRNA表达情况较模型组均有了不同程度的下降，其中模型中药MSC组的下降最为显著，其次是模型中药组，模型MSC组下降幅度最小（P < 0.05）。见图 6。

2.5 MSC及补肺活血方对大鼠VE-cadherin、α-SMA、Snail、MMP9蛋白表达情况的影响

各组大鼠VE-cadherin的表达情况经统计学分析后不符合正态分布，改用Kruskal-Wallis H检验，结果显示各组间差异具有统计学意义（H=13.524，P < 0.05）。基于SPSS成对比较功能进行组间两两比较，并采用Bonferroni法进行多重比较校正（校正后的P < 0.05为差异具有统计学意义）。结果显示：与空白组相比，模型组VE-cadherin灰度值降低，具有统计学意义（P < 0.05）；与模型组相比，剩余3组VE-cadherin灰度值均有所升高，且模型中药MSC组升高幅度最大，模型中药组次之，模型MSC组升高幅度最小，但经统计学分析后，其差异均无统计学意义（P > 0.05）。各组大鼠Snail的表达情况经统计学分析后同样不符合正态分布，改用Kruskal-Wallis H检验，结果显示各组间差异具有统计学意义（H=13.033，P < 0.05）。基于SPSS成对比较功能进行组间两两比较，并采用Bonferroni法进行多重比较校正（校正后以P < 0.05为差异具有统计学意义），组间比较结果显示：与空白组相比，模型组Snail灰度值升高，具有统计学意义（P < 0.05），与模型组相比，剩余3组Snail灰度值均有所降低，且模型中药MSC组降低幅度最大，模型中药组次之，模型MSC组降低幅度最小，但经统计学分析后，其差异均无统计学意义（P > 0.05）。各组大鼠α-SMA、MMP9的表达情况经统计学分析后符合正态分布，结果显示：与空白组比较，模型组α-SMA、MMP9灰度值均升高，具有统计学意义（P < 0.05），模型MSC组、模型中药组、模型中药MSC组在分别经过尾静脉注射MSC、补肺活血方灌胃以及两者联用的治疗处理后，3组大鼠的α-SMA、MMP9的表达情况较模型组均有了不同程度的下降，其中模型中药MSC组的下降最为显著，其次是模型中药组，模型MSC组下降幅度最小（P < 0.05）。见图 7、8。

2.6 MSC及补肺活血方对大鼠VEGF、TNF-α、IL-6因子表达情况的影响

模型组VEGF、TNF-α、IL-6的浓度较空白组有显著提高，而模型中药组、模型MSC组、模型MSC中药组在分别经过尾静脉注射MSC、补肺活血方灌胃以及两者联用的治疗处理后，3组大鼠的VEGF、TNF-α、IL-6的浓度值较模型组均有了不同程度的降低，其中模型中药MSC组的降低最为显著，其次是模型中药组，模型MSC组降低幅度最小（P < 0.05）。见图 9。

3 讨论

肺动脉高压是临床上常见的心血管疾病，发病受多种因素影响，其中低氧可以使肺动脉压力升高、血管收缩增加，诱发EndoMT过程，形成像内皮细胞损伤、平滑肌细胞增多等不可逆的肺血管结构性重塑，同时低氧还会诱发肺血管炎症反应，造成多种蛋白、细胞因子的表达增加 ^[12]。而中医虽无肺动脉高压病名，却在经典著作中有相似记载，主要以肺胀、喘证、水气等方面论治 ^[6]，临床上目前对于肺动脉高压治疗手段有限，静脉注射干细胞作为一种新型有效的治疗方式可以有效改善肺动脉高压造成的血管器质性病变，除此之外，中药对于肺动脉高压症状亦有良好的改善作用。EndoMT可以使血管内皮细胞向间充质样细胞转化 ^[13]，造成血管内皮细胞功能障碍，血管障碍被破坏，进而促进肺血管重构，加重肺动脉高压。本研究旨在探讨补肺活血方联合MSC移植治疗肺动脉高压大鼠的疗效及作用机制。通过对比各组在改善RVHI、间充质类细胞标志物及相关调控因子的表达情况和降低炎症反应等方面的效果，结果表明模型中药MSC组的各项指标均显著优于其他各组。这些结果证明了补肺活血方与MSC联合应用在治疗肺动脉高压中的显著疗效。

右心室肥厚及肺血管重构等均为肺动脉高压的特征性病理改变，当肺动脉压力升高时，为了维持正常的心输出量，右心室心肌细胞会发生代偿性肥大，同时肺动脉平滑肌细胞也会异常增殖迁移，导致血管壁增厚 ^[14]。实验结果显示，模型中药MSC组的WT%和WA%显著降低，且降低幅度大于模型中药组及模型MSC组，这表明补肺活血方与MSC联用可以有效改善肺动脉高压引起的器质性病变，且效果优于单用尾静脉注射MSC或单用补肺活血方灌胃，体现了联用方案的增效优势，有效延缓疾病的发展。结果显示各组大鼠RVHI之间的差异具有统计学意义，与空白组相比，模型组RVHI升高，差异具有统计学意义（P < 0.05），这提示本实验造模成功，而造成其余各组两两比较差异无统计学意义（P > 0.05）的原因，可能与大鼠个体素质差异过大及样本过少有关，虽选材时将实验大鼠的体质量控制在一定范围，但在小样本实验中，个体差异（如心肌发育、代谢速率及对低氧环境耐受度）依然存在，其次在最终的解剖取材过程中，分离部位的不精准以及称质量误差可能是造成这种情况的直接原因。此外，也有可能是因为补肺活血方与MSC的给药量或给药时间少，不足以逆转大鼠RVHI升高这一器质性病变。伍雪橙等 ^[15]在研究吸入2-氰基-3，12-二氧齐墩果烷-1，9（11）-二烯-28-酸甲酯（CDDO-NO）对大鼠肺动脉高压的作用时发现，同一药物的高剂量组与低剂量组之间差异无统计学意义，不同药物的低剂量组之间差异亦无统计学意义，这提示大鼠RVHI的改善可能需要更大的药物剂量。EndoMT过程与多种生物因子有关，其可以导致α-SMA等间充质细胞特征蛋白表达增加，VE-cadherin等内皮细胞特征蛋白表达减少 ^[16]。实验结果表明，补肺活血方与MSC联用可以使肺动脉高压大鼠VE-cadherin的表达升高而α-SMA的表达降低，相较于模型组，模型中药MSC组相关指标的改善均优于模型中药组及模型MSC组，这说明两者联用对EndoMT过程有更好的抑制作用，效果比MSC或补肺活血方的单方案应用更为明显，有效保护了内皮细胞屏障的完整性，延缓了肺血管生理结构的重塑，减轻EndoMT对疾病的影响。Snail及MMP9也在EndoMT过程中起到重要的作用。Snail蛋白可以抑制VE-cadherin蛋白的表达，从而破坏内皮细胞之间的链接，诱发EndoMT的启动。MMP9则通过降解细胞外基质促进EndoMT的发生 ^[1]。实验结果显示，相比于模型组，模型中药MSC组对Snail、MMP9表达的降低效果优于模型中药组及模型MSC组，这表明补肺活血方及MSC细胞联用可以显著降低Snail、MMP9表达，抑制EndoMT过程的发生发展，且这一效果强于两者单用的应用方案，为“联用增效”的结论提供有力支撑。VEGF与肺动脉高压的过程密切相关，有研究表明低氧性肺动脉高压会引起血清中VEGF的高表达 ^[17]，也有研究证实VEGF可通过增厚血管壁、增加血管渗透性等方式引发炎症反应 ^[18]，此外TNF-α和IL-6可以引发炎症反应并促进肺动脉高压的发生 ^[19]。本研究结果显示联合用药可以显著降低大鼠VEGF、TNF-α、IL-6因子的表达，且这一效果优于MSC及补肺活血方的单独应用，对于VEGF的降低，可能是补肺活血方与MSC对EndoMT产生了抑制，从而改善了血管的损伤，亦有可能是其降低炎症反应的发生导致的。而TNF-α、IL-6促炎因子的降低则说明联合用药方案对控制炎症具有更加突出的疗效。

值得一提的是，本实验针对VE-cadherin、α-SMA、Snail、MMP9等物质的检测采用多种方法，在Western blot检测中，发现VE-cadherin、Snail表达不符合正态分布，采用Kruskal-Wallis H检验后，结果显示各组间差异具有统计学意义，但组间比较显示，空白组与模型组比较差异具有统计学意义（P < 0.05），提示本实验造模成功，但其余各组数据与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。造成这种情况的原因有可能是样本量偏小所导致的统计效力不足，本研究每组6只SD大鼠，属于小样本设计。此外Western blot检测作为一种半定量分析，对VE-cadherin、Snail这类敏感指标检测，有一定的局限性。VE-cadherin作为大分子蛋白，转膜效率低，Western blot检测无法确定蛋白的具体含量，导致各组之间差异不显著。而Snail蛋白作为转录因子，它的半衰期仅15 min，是一种极不稳定的蛋白质 ^[20]，其含量具有波动性，个别大鼠肺组织中Snail蛋白含量可能已不足以显示出具有显著差异的结果，而本实验由于样本量偏少，可能会放大这种影响。其次造成这种结果也可能与取样偏差、样本处理、检测机器误差等步骤相关，这些环节都可能造成结果差异的不显著。

本实验所选用的补肺活血方组成为丹参20 g，红花10 g，郁金12 g，黄芪20 g，该方剂以“肺朝百脉”“气虚血瘀”理论为基础设立，符合肺动脉高压的病机。本方强调补气与活血的结合，通过黄芪的补益肺气作用与丹参、红花、郁金的活血化瘀作用相结合，可以达到扶正祛邪、改善整体气血状态的效果。中药的多成分、多靶点作用特点，使其能够同时调节多个病理过程。研究表明单味中药及复方不仅能够通过提高MSC归巢率来增强其治疗效果，还可以改善肺血管结构的重塑 ^[2，21]，并通过多种信号通路抑制EndoMT的发生与发展，俞丽华等 ^[3]发现丹参注射液可以通过调控TGF-β/Smad信号通路来改善EndoMT，洪梦云 ^[22]发现丹参饮通过LIM和SH3结构域蛋白1（LASP1）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号轴来抑制EndoMT，具有补肺活血功能的中药复方亦有此效；李鹏等 ^[23]在研究中发现：补肺活血胶囊可以有效抑制由含热蛋白结构域的NOD样受体3（NLRP3）通路导致的EndoMT；杨其芬等 ^[24]通过制备补阳还五汤含药血清干预人肺动脉内皮细胞，发现其可以抑制EndMT过程中Wnt1/β-catenin信号通路的激活；Chen等 ^[25]研究发现补肾活血益气方可通过调节沉默信息调节因子2同源蛋白1（SIRT1）/Notch受体1（Notch1）通路来抑制EndoMT过程；王咏等 ^[26]通过实验研究表明黄芪-红花-葶苈子药对可有效下调α-SMA蛋白的表达，并通过调控TGF-β/Snail通路有效抑制EndoMT。除此之外，中药的免疫调节功能还可以起到抗炎、抗氧化应激等作用 ^[27]，可以减轻干细胞移植过程中可能引起的免疫反应和排斥反应，从而提高治疗的安全性。而且补肺活血方在改善症状方面具有独特优势，可以明显减轻气短、胸闷等临床表现。MSC能够直接参与受损组织的修复和再生，特别是分化为血管内皮细胞，修复受损的肺血管，有效降低肺动脉压力，同时MSC还能分泌多种细胞因子，促进血管生成和组织再生 ^[28]。联合治疗将中药整体调节与MSC局部修复相结合，有望实现短期内减轻症状，长期内达到血管结构的重塑和功能的恢复，标本同治，实现对肺动脉高压的多靶点、综合性治疗，最大化治疗效果。

4 结论

综上所述，补肺活血方联合MSC移植可以通过抑制EndoMT过程实现对肺动脉高压大鼠的增效治疗，联合用药显著降低了肺动脉压力，改善了右心功能，减轻了肺血管重构和炎症反应，抑制了EndoMT过程的发生发展，且效果优于补肺活血方或MSC注射的单方案治疗。本研究为中西医结合治疗肺动脉高压提供了新的思路和方法，具有重要的理论意义和临床应用前景。

尽管本研究取得了显著的效果，但仍存在一些局限性。补肺活血方与MSC联用抑制EndoMT的过程，及哪一种信号通路起作用尚不明确，具体机制有待研究，同时有些实验结果比较差异无统计学意义，需进一步扩大样本量、优化实验步骤、规范操作流程，以获得更精准的数据。