随着人们物质生活水平的提高，动脉粥样硬化(AS)的发病率逐年升高。复杂的AS斑块往往结构不稳定，易发生破裂或糜烂，后者因动脉内皮缺失启动凝血系统促进血栓形成，导致心肌梗死等急性心血管事件发生，乃至危及生命。世界卫生组织(WHO)报道^[1] AS所致的急性心血管事件2012年病死人数为740万，占总病死人数的13.2%，病死率较2000年上升23.3%，成为全球首位死因。

高胆固醇血症是AS发生的物质基础。因此，降低血浆胆固醇水平是抗AS重要治疗手段。3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是胆固醇合成的限速酶，直接影响胆固醇的合成速率和血浆胆固醇的水平。目前，辛伐他汀作为HMG-CoA的抑制剂，被临床广泛用于降低血浆胆固醇，防治AS。但近年来发现辛伐他汀作用机制复杂，除降低胆固醇外，可通过抗炎、抗凋亡等抑制AS的发生发展^[2]。AS斑块破裂或糜烂继发血栓形成是AS的常见并发症和致死原因。辛伐他汀抗AS所致血栓形成疗效和机制尚待进一步证实。因此，本实验复制AS不稳定斑块家兔模型，观察辛伐他汀对该模型血栓形成的影响，为拓展辛伐他汀的临床应用范围提供实验支持。

26只SPF级雄性新西兰家兔，体质量2.4~2.9 kg(购自北京龙安实验动物繁育中心)。

辛伐他汀片(舒降之，杭州默沙东制药有限公司)，高脂饲料(1%胆固醇+5%猪油+5%蛋黄粉+89%基础饲料，其中胆固醇购自天津市大茂化学试剂厂)，鲁塞尔蝰蛇毒(RVV，Sigma Chemical Co，美国)，组胺(Sigma Chemical Co，美国)，血管性血友病因子抗原(vWF:Ag，上海索莱宝生物技术有限公司)，D-二聚体(D-Dimer，上海易生物技术研究所)，血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)放免试剂盒(解放军总医院科技开发公司)，球囊导管及附件(Cordis公司，美国)，微机多探头γ计数仪(FT-630G型，北京)，体视显微镜(Olympus，SZXY7，日本)，多功能微孔读板机(Endpine，美国Perkin Elmer公司)。

将26只家兔称重后，按体质量从轻到重依次1~26号排列，依照安全随机法，利用Excel文件中的“随机数发生器”进行随机分组，其中，一组作为假手术组(n=8)，始终给予正常饮食，其余18只家兔给予高脂饲料饲养4周，行腹主动脉球囊拉伤术。模型制作过程简述如下：3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉，同时静脉给予肝素(200 U/kg，以防止插管过程中发生凝血)，切开右股动脉，结扎远心端。沿0.014的导丝从股动脉切口逆行插入球囊(内径3.5 mm，长15 mm)约20 cm，回抽3 cm，连接手推式压力泵，注入肝素生理盐水，膨至8个大气压，向着髂总动脉轻柔回拉，重复3次，行腹主动脉壁气囊拉伤术。假手术组：家兔仅行腹主动脉切口，并不进行球囊拉伤。术后常规注射抗生素3 d以预防感染。

模型制作过程中，因麻醉意外和失血过多死亡2只。模型制作成功的16只家兔继续给予4周高脂饮食后转为正常饮食，并按上述随机分组法再次随机分为模型组(n=8)和辛伐他汀组(n=8)。辛伐他汀组给予10 mg/(kg·d)的辛伐他汀混悬液灌胃干预4周，相同干预时间内假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃。

药物干预结束后，参照Constantinides 等^[3]方法将所有家兔行药物触发：腹膜下注射蛇毒(RVV，0.15 mg/kg)，30 min后，经耳缘静脉注射组胺(0.02 mg/kg)，于处死动物前24 h和48 h分别给予2次触发。

于处死动物前，禁食12 h，不禁水。经耳缘静脉取血，2%EDTA Na₂抗凝，离心(3 000 r/min)30 min获得血浆；取腹主动脉，生理盐水冲洗后，纵行剖开腹主动脉，平铺于滤纸上，体视显微镜下观察可视血栓形成情况。

取各组家兔血浆，采用ELISA法测定血浆中vWF:Ag 和D-二聚体，严格按照试剂盒说明书操作。

以¹²⁵I-TXB2和¹²⁵I-6-keto-PGF1α为示踪标记物，采用放射免疫分析法测定血浆TXB2和6-keto-PGF1α的浓度，严格按照试剂盒说明书操作，并计算TXB2/6-keto-PGF1α的比值。

采用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料实验数据以均数±标准差(x ± s)表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett'T₃法，组间率的比较采用卡方检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

球囊拉伤后合并高脂饮食8周后，变换为正常饮食并给予药物干预4周后，以蝰蛇毒和组胺诱导斑块破裂和血栓形成。体视显微镜下，可见假手术组无斑块和血栓形成(0%)，模型组和辛伐他汀组斑块血栓受损继发血栓形成率分别为6/8(75%)和2/8(25%)，见表 1。模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0．01)；辛伐他汀组与模型组相比差异有统计学意义(P＜0．05)。

结果显示，模型组动物高胆固醇饮食合并球囊损伤，可提高血浆vWF:Ag和 D-二聚体水平，与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0．01)。辛伐他汀干预4周后，血浆vWF:Ag和 D-二聚体水平均降低，与模型组相比差异有统计学意义(P＜0．01)，提示辛伐他汀对血浆vWF:Ag和 D-二聚体有明显的抑制作用，见表 2。

结果显示，模型组动物高胆固醇饮食合并球囊损伤后，血浆TXB2浓度升高、6-keto-PGF1α浓度降低、TXB2/6-keto-PGF1α升高，与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0．01)。辛伐他汀干预4周后，血浆TXB2浓度、TXB2/6-keto-PGF1α降低、而6-keto-PGF1α浓度升高，其中，TXB2和6-keto-PGF1α与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；TXB2/6-keto-PGF1α与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，提示辛伐他汀可降低血浆TXB2浓度、升高6-keto-PGF1α浓度，进而降低TXB2/6-keto-PGF1α，见表 3。

动脉粥样硬化发生临床急性事件最基本的深层原因，是复杂动脉粥样斑块易损，在此基础上斑块破裂或者糜烂合并血栓形成。高胆固醇饲料喂养易于形成腹主动脉易于形成斑块,然而，持续高胆固醇饮食形成的斑块往往以泡沫细胞为主，难以形成与人体类似的复杂斑块。实验研究显示^{[4, 5]}，AS本身与血管内皮细胞功能紊乱关系密切相关，内皮细胞受损或功能障碍是AS的始动因素。因此，笔者采用高胆固醇饮食的基础上，行球囊拉伤术损伤腹主动脉内皮细胞，促进斑块形成的数量和严重程度；高胆固醇饮食8周后，改为普通饮食，研究显示降低胆固醇水平，促进斑块不稳定。在此基础上，采用蝰蛇毒和组胺使血管交替强烈收缩和舒张，促进不稳定斑块破裂或糜烂。本研究结果显示，上述模型动物腹主动脉处发生明显的斑块糜烂、破裂和继发血栓形成，与Gang等^[6]人的研究类似，提示不稳定斑块继发血栓形成的动物模型制作成功。辛伐他汀可降低上述模型血栓形成，提示辛伐他汀具有抗血栓功效。AS的不稳定斑块易形成血栓，是多种因素共同作用的结果。为阐述辛伐他汀抗血栓形成的机制，本研究利用此模型进一步观察与血栓形成的相关指标的改变。

内皮细胞功能障碍或受损不但是AS始动因素，而且功能障碍和受损的内皮细胞又释放大量的vWF，其具有使血小板与胶原或其他表面黏附的桥梁作用，进而导致AS病变处易形成血栓。本研究显示球囊损伤内皮细胞的动物模型中血浆vWF浓度升高，提示球囊损伤是AS本身和诱导斑块破裂的因素，均导致内皮细胞功能障碍。辛伐他汀有效降低上述动物模型的vWF水平，提示该药抑制血栓形成的机制与保护内皮细胞受损伤有关。

D-二聚体是凝血酶及因子Ⅻ作用下的交联纤维蛋白经纤溶酶降解作用后一种特异性降解产物。可反映凝血和纤溶系统的激活，是目前公认的体内活动性血栓形成的特异性分子的标志物^[7]。大量临床研究^[8]显示在AS病变中，D-二聚体能沉积于血管壁，直接损伤血管内膜；同时还能促进血小板黏附和聚集，使血液处于高凝状态，进而加速血栓形成。本研究中模型组的D-二聚体检测明显高于假手术组，说明该模型制备后血液处于高凝状态，易于在不稳定斑块中发生血栓形成。而辛伐他汀有效降低了模型动物的D-二聚体浓度，提示该药物可逆转高凝状态，发挥抗血栓功能。

TXB2和6-keto-PGF1α是TXA2和PGI2的稳定代谢产物，以两者含量间接反映半衰期极短的TXA2和PGI2浓度。TXA2和PGI2是一组由血液中血小板和血管内皮细胞释放的血管活性物质，TXA2促进血管收缩和血小板聚集，PGI2舒张血管和抑制血小板聚集，两者相互拮抗。正常情况下在血液中两者含量及比值保持相对平衡状态，使血管舒张有度，既不形成血栓也不发生出血^[9]。临床研究^[10]发现AS患者血管损伤处有大量血小板黏附，易形成血栓，TXA2增高，而PGI2降低，导致两者平衡失调。一旦两者失衡，则促进血小板聚集，加速血栓形成。本研究实验结果显示，模型组中TXB2增高，6-keto-PGF1α减低，两者比值明显升高，提示该模型血管内皮细胞受损，循环血液中的血小板黏附在损伤部位、被激活、释放TXA2，进一步促进血小板聚集，加速血栓形成。辛伐他汀能有效提高6-keto-PGF1α浓度、降低TXB2浓度，促进两者比例平衡，进一步提示辛伐他汀具有保护内皮细胞、抑制血小板激活进而发挥抗凝作用。

综上所述，本实验通过球囊拉伤术后药物触发制备不稳定斑块血栓形成的模型，进而研究辛伐他汀抗AS的血栓形成的机制，实验结果显示辛伐他汀可能通过修复损伤的血管内皮细胞，改善血液高凝状态，抑制血小板聚集等，发挥抗血栓形成的作用，本研究为辛伐他汀临床针对AS不稳定斑块患者，预防其血栓形成提供了实验依据。