痛风性关节炎(GA)是由于血液尿酸增高,尿酸盐结晶(MSU)沉积在关节囊、滑膜、软骨、骨质等关节组织,刺激关节而引起的关节滑膜及周围组织病损及炎症反应^[1]。由于长期嘌呤代谢障碍导致血尿酸增高,而高尿酸血症及原发性痛风与肥胖症、高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病呈显著正相关^[2],因此痛风性关节炎对人类健康具有极大的危害^[3]。目前治疗痛风性关节炎的药物主要是秋水仙碱、解热镇痛药、糖皮质激素药等,其不良反应如胃肠毒性、肾毒性或胃肠道出血等^{[4, 5, 6]},给患者带来巨大的痛苦。因此,寻求高效低毒的药物对于治疗痛风性关节炎具有十分重要的意义。

布依族是中华民族大家庭中的一员,人口约有300 多万,布依族历史悠久,人民勤劳勇敢,曾被誉为"水稻民族",与其他民族一样,布依族在发展和壮大的过程中,也创造了自己独特、丰富的医药文化。布依医认为危害人们身体健康的因素很多,但主要是气候环境、饮食及意外伤害3种因素。强调诊病时要辨其寒热,用药也分凉性药与热性药两大类,即用凉性药清其热,用热性药散其寒^[7]。由于布依族所处黔西南、黔南地区气候炎热多雨,人群患风湿、类风湿等关节性疾病较多,因而布依族医药积累了丰富的治疗外伤和关节性疾病的经验。

神阙散是贵州布依族民间验方,其药方组成为九节风、阴阳莲及铁马鞭等8味云贵高原野生植物药材,临床具有疏风通络,活血化瘀,软坚散结的功效,多年来一直应用于痛风性关节炎的治疗,其临床发挥疗效较快,治愈率较高,且无毒副作用。但其治疗作用一直缺乏相应的实验支持,故本研究为神阙散治疗痛风性关节炎提供一定的实验依据。

神阙散免煎剂在中央民族大学中试实验室制成。秋水仙碱(购自昆明制药集团股份有限公司)、痛风定胶囊(购自四川升和药业股份有限公司)、氧嗪酸钾盐(购自Sigma)、酵母膏(购自北京奥博星生物技术有限公司)、腺嘌呤(购自Sigma)、肌酐检测试剂盒(购自宁波瑞源生物科技有限公司)、尿酸试剂盒(购自宁波瑞源生物科技有限公司)、尿素氮检测试剂盒(购自宁波瑞源生物科技有限公司)、脱钙液(北京中杉金桥进口脱钙液,批号ZLI-9307)、包埋乙醇和二甲苯(天津永大试剂有限公司)、石蜡(北京北化康泰临床试剂有限公司,熔点为56~58 ℃)、乙醇和二甲苯(天津永大试剂有限公司)、苏木素染液(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号ZLI-9615)、分化液(上海源叶生物有限公司)、反蓝液(上海源叶生物有限公司)、伊红染液(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号ZLI-9614)、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号ZLI-9555)。

健康雄性Wistar大鼠140只,体质量190~220 g[购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2012-0001],分为高尿酸血症和痛风性关节炎两个实验组,每个实验组70只。在高尿酸血症实验中,实验前饲养1周以适应环境,按体质量采用完全随机法分为7组,连续给药1周,其中造模前溶媒对照组按照造模方法给予蒸馏水作为模型对照,造模后溶媒对照组为在造模基础上给予蒸馏水灌胃作为给药对照,西药对照组秋水仙碱按体质量给予0.15 mg/kg;中药对照组痛风定胶囊按体质量给予624 mg/kg;神阙散高剂量组按体质量给予504 mg/kg;神阙散中剂量组按体质量给予252 mg/kg;神阙散低剂量组按体质量给予126 mg/kg;神阙散低剂量1/2组按体质量给予63 mg/kg。在痛风性关节炎实验中,用药组大鼠分为7组:分别为正常组(按照造模方法给予生理盐水)、对照组(造模基础上给予生理盐水灌胃)、西药对照组秋水仙碱组、中药对照组痛风定胶囊组、神阙散高剂量组、神阙散中剂量组和神阙散低剂量组,每组10只小鼠,其给药剂量均与高尿酸血症给药相同。

电子称(常州市衡正电子仪器有限公司),全自动生化分析仪(东芝,型号TAB-40F2),离心机(北京白洋医疗器械有限公司),尿酸(Sigma),足趾容积测量仪(济南益延科技发展有限公司,型号yls-7b),显微镜(日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11),CMOS(日本奥林巴斯),多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus),石蜡切片机(德国莱卡RM2015),低温冰箱(日本三洋MDF-382E型),移液器(德国Eppendorf),恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型)。

大鼠高尿酸血症模型的建立:实验前饲养1周以适应环境,每组动物自由饮食1周进行给药,给药前称大鼠体质量,除正常组灌胃给予蒸馏水外,其余各组灌胃酵母膏按体质量18 g/kg,腺嘌呤按体质量100 mg/kg。在各组取材前1 h给予氧嗪酸钾盐300 mg/kg。

大鼠痛风性关节炎模型的建立:在无菌条件下将5 mmol/L的氢氧化钠(NaOH)和800 mg尿酸钠加入155 mL去热原的灭菌注射用水中并煮沸,使尿酸钠完全溶解,自然降温并搅拌,滴入1 mol/L的盐酸(HCl)至pH值7.0,溶液呈乳白色后反复离心(3 000 r/min) 2 min,最后于4 ℃冷却1 h后离心,收集晶体于无菌EP管,4 ℃保存。烤干上清、烧杯、搅棒和离心管,称重,将实验后减去实验前器械重量加上生成氯化钠的量即为所得晶体的重量。再将尿酸盐结晶(MSU)晶体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中配成所需浓度。此方法制备的MSU晶体可均匀混悬于PBS中。参照大鼠急性痛风性关节炎的建立模型^{[8, 9]},麻醉大鼠后,选右踝关节外侧后方为穿刺点,针口斜面朝前上方与胫骨成45°夹角刺入踝关节腔,以4.5号针头向关节腔一次性注入50 μL浓度为20 g/L MSU溶液。

实验前和实验后各第7天,眼内眦静脉取血,离心半径23 cm,2 500 r/min离心5 min,每份血样取200 μL上清液测定血清尿酸、肌酐、尿素氮。

用药组大鼠于诱发模型前5 d开始灌胃给药,每日1次,连续7 d。第2、4、6、8、24、48 h观察肿胀指数和组织病理变化。肿胀指数定义:通过2~3 mm宽纸条和游标卡尺测量实验前和诱导炎症后不同时间的关节周径,关节肿胀指数=(测定时间点关节周径-初始周径)/初始周径^[10]。在此基础上,取各组大鼠冲洗干净的骨组织,置于10倍本身体积的脱钙液[脱钙液需用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液]中,每周更换脱钙液,定期检查组织酥软程度(以大头针轻松扎入骨组织即可),脱钙完成后,固定、脱水、石蜡包埋、切片,然后进行脱蜡和复水及苏木精-伊红(HE)染色,镜下观察,采图分析。治疗结束后,将所有的动物处死按照上述方法取材,并记录相关数据。

实验数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料采用(x±s)表示,组间差异采用单因素方差分析(ANVOA),组间两两比较若方差齐采用LSD法,若方差不齐采用Dunnett's T₃法,检验水准α=0.05。

在尿酸实验结果中,除痛风定组和神阙散低剂量及1/2低剂量组外,其余给药组差异有统计学意义(P<0.01),可见秋水仙碱、神阙散高剂量组和神阙散中剂量组降低尿酸的疗效较为显著。在肌酐实验结果中,神阙散高剂量组及神阙散中剂量组差异具有统计学意义(P<0.05),说明神阙散中、高剂量组对降低高尿酸血症的肌酐具有明显疗效。对于尿素氮实验结果,神阙散中、高剂量组均具有统计学意义。见表 1。

除正常组外,在给药前,各组大鼠的肿胀指数值呈上升趋势,符合疾病发展的规律,给药2 h后,可见所有实验组的肿胀指数升高。4 h后秋水仙碱组、痛风定组以及神阙散高剂量组肿胀指数降低。6 h后,神阙散低、中、高剂量组肿胀指数均降低。8 h后所有给药组均有下降。至48 h后所有实验组均恢复至给药前水平。从下降趋势可以看出除了神阙散低剂量组疗效不明显外,其他给药组对痛风性关节炎大鼠均有治疗作用,而神阙散高剂量组的作用明显优于其他用药组,神阙散中剂量组与痛风定组和秋水仙碱组的疗效相当。见图 1。

图 1 肿胀指数升降趋势图

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由图 2病理结果可见,在低倍显微镜和高倍显微镜下观察骨组织,正常组滑膜及周围组织正常,无炎细胞浸润,关节腔清晰,无炎性细胞及渗出物。而对照组滑膜及周围组织可见大量急、慢性炎细胞浸润,伴关节腔内大量渗出物和炎细胞并血管扩张充血。痛风定组的滑膜及周围组织中度炎症,可见急、慢性炎细胞浸润,伴关节腔内少量渗出物和炎细胞,并血管扩张充血。秋水仙碱组的滑膜及周围组织中度炎症,可见慢性炎细胞浸润,伴关节腔内少量渗出物和炎细胞,并血管扩张充血。神阙散低剂量组的滑膜及周围组织中度炎症,可见急、慢性炎细胞浸润,关节腔内有少量渗出物和炎细胞,血管仍然扩张充血。神阙散中剂量组的滑膜及周围组织轻度炎症,可见散在急、慢性炎细胞,集中于滑膜区,关节腔内未见渗出物和炎细胞。神阙散高剂量组的滑膜及周围组织正常,偶见炎性细胞,关节腔清晰,无炎性细胞及渗出物。

图 2 各组大鼠病理形态(HE 染色)

图选项

目前治疗痛风性关节炎的主要药物有秋水仙碱、解热镇痛药、糖皮质激素以及中药痛风定胶囊等。其中临床一般认为秋水仙碱为治疗痛风性关节炎的首选药物,痛风性关节炎发作最初几小时内服用疗效最好,24 h内疗效约有75%,24 h后疗效降低,但其有效剂量与中毒剂量相近,使得其疗效受到限制。非甾体类解热镇痛药疗效较好,适用于对秋水仙碱不耐受者,但不良反应较多,譬如过敏反应、消化道出血等,另外消化性溃疡病史、肾脏疾病、肝脏疾病、心功能不全以及服用抗凝药物者慎用,老年患者也应当慎用。糖皮质激素起效快,但停药后症状易复发,不良反应多。可见西药治疗痛风性关节炎有许多不良反应^[4]。近年来,中医药在改善痛风性关节炎的症状及缓解症情方面具有明显的优势,安全性较好,复发率低^[11]。如中药制剂痛风定片对关节红肿热痛确有疗效,能明显降低血尿酸水平,在临床中未发现明显的不良反应^[12]。

布依族是贵州的土著民族之一,在治疗潮湿山区的多发病方面总结了许多有效的民族方药^[13]。布依族医药理论认为痛风性关节炎为外感风寒湿邪,邪阻经络,内有气血亏虚。风、寒、痰、湿、热、虚等交相为害,血瘀络阻,受累脏腑以脾肾为甚。朱良春教授也认为痛风是浊毒瘀滞血中,不得泄利所致,水谷不归正化,浊毒随之内生,滞留血中终致瘀结为患^[14]。神阙散是布依族中治疗痛风性关节炎的常用验方,其中九节风具有清热解毒凉血,活血消斑散瘀,祛风除湿通络的作用,之前的研究显示九节风可能是通过稳定内皮细胞的代谢活性,调节由于内毒素休克引起的血管内皮细胞分泌功能以及尿酸盐引起的血管内皮细胞分泌功能的紊乱,抑制炎症因子白细胞介素-1(IL-1)的过度释放,阻断了炎症的级联反应,从而具有治疗作用^{[15, 16]}。阴阳莲提取物能明显降低血尿酸,其机制为抑制黄嘌呤氧化酶活性,使尿酸的生成减少,血清尿酸水平下降,同时还能明显降低急性痛风性关节炎中的炎性因子的含量,缓解炎性症状,阻止炎症状态进一步发展^[17]。

本研究从模型动物层面证实神阙散能有效治疗模型大鼠痛风性关节炎,其在显著降低高尿酸血症的尿酸、肌酐和尿素氮的基础上,对急性痛风性关节炎具有较为明确的治疗作用,特别是相比现有用于治疗痛风性关节炎的药物,神阙散的治疗优势较为明显。同时课题组还进行了神阙散的安全性评价研究,证实了该方剂具有安全无毒副作用的特点^[18],使其成为治疗痛风性关节炎较为理想的药物。本研究为神阙散的治疗作用提供了实验支持,为神阙散治疗痛风性关节炎的开发应用提供了一定的实验基础。