马尾松(Pinus massoniana Lamb.)为松属植物,是中国亚热带南部潮湿地区分布最广、资源最大的树种。松针是马尾松的叶子,现代研究表明松针具有抗炎、镇咳、抗突变、降血脂、降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇等作用,近年来医学临床上用来治疗感冒、咳喘、腹痛肠炎、高血压、肿瘤等^[1]。民间有采用新鲜松针治疗高血压病的实例^[2],也有学者用含松针的中成药治疗心血管疾病的案例,如陈维云等^[3]报道了参松养心胶囊治疗慢性心力衰竭的临床观察,且都取得了较为满意的效果。

有学者进行关于降血压中药影响血管内皮舒缩因子的研究^[4]。但是关于松针提取物通过调节血管舒缩因子平衡的研究在国内外研究中尚未见相关报道。本次实验以两肾一夹(2k1c) 高血压大鼠为实验对象,选取代表血管舒张因子(EDRF)的一氧化氮(NO)和血管收缩因子(EDCF)的血管内皮素(ET)为指标,通过监测大鼠舒张压(DBP)和收缩压(SBP)、血清中NO和血浆中ET两个指标来研究松针提取物降血压的作用。

SPF级SD大鼠60只,体质量150~180 g,购自广州中医药大学实验动物中心,许可证号SYXK(粤)2013-0001;质量合格证明:NO.44005800000006。

10%水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂),注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司,批号J3048403),0.9%氯化钠(NaCl)注射液(四川科伦大药厂制药有限公司,批号T13070604),松针提取物(规格:10:1,陕西瑞康生物工程有限公司,批号20140118),卡托普利片(规格每片25 mg,山西津华晖星制药有限公司,批号140307)。

大鼠ET酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒,由上海西唐生物科技有限公司提供,批号201404。大鼠NO ELISA检测试剂盒,由上海西唐生物科技有限公司提供,批号201404。

无菌针灸针(规格0.25 mm×25 mm,苏州医疗用品厂有限公司,批号130310),医用真丝编织线(上海浦东金环医疗用品有限公司),真空采血器配套用针(上海康侬医疗器械有限公司),乙二胺四乙酸(EDTA)真空采血管、普通采血管(山东省皮武县华博医疗器械有限公司)。

BP-6动物无创血压测试仪系统(成都泰盟科技有限公司),DENLEY DRAGON Wellscan MK 3全自动酶标仪(芬兰Thermo公司),BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)。

将SD雄性大鼠60只,适应性饲养3 d,选取其中10只作为假手术组,其余50只进行结扎单侧肾动脉手术,建立2k1c动物模型。大鼠称重,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg),开腹分离左肾动静脉。无菌线穿过肾动脉,用直径0.25 mm的无菌针灸针与肾动脉紧贴平行放置,扎紧无菌线,再抽出无菌针灸针。缝合腹腔,注射抗生素,待清醒后置于干净笼内饲养。假手术组只分离左肾,不结扎肾动脉。

手术4周后用BP-6动物无创血压测定仪测定血压,SBP>130 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa,下同)为成模标准,筛选出40只动物模型。按随机数字表法随机分为:模型组、阳性药物组、松针提取物低剂量组、松针提取物中剂量组、松针提取物高剂量组,另加假手术组10只。

按照50、30、20 kg/L的松针提取物配备松针提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组;按照1 kg/L的卡托普利悬浊液配备阳性药物剂量组每日予各组大鼠相应药物灌胃给药1次,每次2 mL,连续灌胃4周。假手术组、模型组予0.9%NaCl溶液。

给药期间大鼠血压每周测定1次。BP-6动物无创血压测试仪预热30 min后,将大鼠置于固定器中,鼠尾套入套袖,适应15 min(37 ℃),动物安静后充气测定大鼠收缩压和舒张压。

各组大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg),称重并记录,经腹主动脉采血。用普通采血管采集制备血清样本,4 ℃下3 000 r/min离心10 min,分离上清液-80 ℃保存,按试剂盒说明测定血清NO的含量。用EDTA采血管采集制备血浆样本,摇匀,4 ℃下3 000 r/min离心10 min,取上清液 -80 ℃以下保存待测,测定血浆ET的含量。

本实验检测ET、NO含量采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ABC-ELISA)法。具体步骤如下:每孔各加入待测样品100 μL,将反应板充分混匀后置37 ℃ 40 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL(空白除外)。将反应板充分混匀后置37 ℃ 20 min。洗板同前。每孔加酶标抗体工作液100 μL。将反应板置37 ℃ 10 min。洗板同前。每孔加入底物工作液100 μL,置37 ℃暗处反应15 min。每孔加入100 μL终止液混匀。30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光值。ET浓度与A值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中ET浓度。

用SPASS 19.0软件进行数据统计,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较若方差齐采用LSD法,若方差不齐采用Dunnett's T3法,P<0.05为差异有统计学意义。

本次实验采用了肾性高血压模型中经典的2k1c大鼠模型,造模50只,1只因术后处理不当互相撕咬致死,无感染,存活率98%,4周后符合高血压标准为40只,造模成功率80%。因灌胃手法不当或取材时血液污染,最后纳入统计的大鼠为模型组7只、假手术组7只、阳性药物组6只、松针提取物高剂量组6只、松针提取物中剂量组7只、松针提取物低剂量组6只^{[5, 6]}。

与模型组比较,假手术组SBP明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);阳性药物组SBP与DBP明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);松针提取物各剂量组,SBP明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),DBP降低但无统计学差异(P>0.05)。松针提取物各剂量组与阳性药物组比较无统计学差异(P>0.05)。见表 1、图 1。

图 1 松针提取物对2k1c大鼠模型血压影响

图选项

与模型组比较,假手术组ET含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性药物组ET含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。松针提取物各剂量组,ET含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。松针提取物各剂量组与阳性药物组比较无统计学差异(P>0.05)。见表 2。

与模型组比较,假手术组NO含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性药物组NO含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。松针提取物各剂量组NO含量明显升高,但无统计学差异(P>0.05)。松针提取物各剂量组与阳性药物组比较无统计学差异(P>0.05)。见表 3。

血压形成取决于心脏收缩、大血管弹性、血液本身、血液的黏稠度及外周阻力等因素。心脏收缩形成SBP,大动脉回缩形成 DBP。在临床中,SBP增高最常见,往往与年龄增长相关,也更难控制,SBP高说明大动脉弹性低,动脉已经硬化,往往比SBP和DBP都高的患者还要严重^[7]。

从实验结果看,模型组大鼠与假手术组比较,SBP、DBP明显升高(P<0.05),具有统计学意义,证明了2k1c大鼠模型造模成功。松针提取物高、中、低剂量组与模型组比较,大鼠SBP明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,DBP降低但无统计学差异(P>0.05)。松针提取物各剂量组与阳性药物组比较无统计学差异(P>0.05)。大鼠血压在第5周至第6周时可趋于稳定,松针提取物及卡托普利在用药后1周可出现大鼠血压低于模型组,松针提取物各组用药后2周血压值趋于稳定,但卡托普利组血压值继续下降。实验结果提示,松针提取物各剂量组均对SBP有一定程度的降低作用,且可以避免临床上长期服用降压药导致的血压值偏低现象,降压效果比较温和。

高血压是当今危害人类健康的重要疾病,严重影响心、脑、肾等靶器官的功能,人群患病率高,且有逐年上升趋势^[8]。目前研究表明,血管内皮功能障碍与高血压密切相关。覆盖血管内膜面的内皮细胞能生产、激活和释放各种血管活性物质,通过释放血管内皮依赖性舒张因子和收缩因子调节血管平滑肌细胞以维持血管张力。血管内皮发挥调节血管舒缩功能是通过调控舒张因子NO、血浆前列环素(PGI2)与ET、血栓系B2(TXB2)的释放平衡来实现的。ET和NO是体内血管内皮细胞结构及功能状态的重要标志物,其保持动态平衡在血管平滑肌功能及血管张力调节系统中具有很重要作用,在正常生理情况下ET和NO之间相互制约,使血压维持在一定的水平^{[9, 10]}。

实验结果表明,模型组与假手术组比较,ET含量明显升高(P<0.05),NO含量明显降低(P<0.05),都具有统计学意义,符合造模成功标准。阳性药物组与模型组相比ET含量明显降低(P<0.05),NO含量明显升高(P<0.05)。松针提取物中剂量组与模型组相比,ET含量明显降低(P<0.05),具有统计学意义,NO含量明显升高,但无统计学差异(P>0.05)。松针提取物各剂量组与阳性药物组比较无明显差异(P>0.05)。松针提取物可能通过抑制内皮衍生收缩因子ET的释放,而促进内皮依赖性舒血管物质NO的释放,调节ET和NO间平衡状态,从而舒张血管,降低外周阻力,减少回心血量,从而达到降低血压效果。本实验动物给药时间过短,且实验组高、中、低剂量组剂量梯度过小可能是造成实验组结果差异不明显的主要原因。

实验结果表明,松针提取物可以明显降低2k1c大鼠SBP和DBP,尤其对于SBP效果显著,与临床经典药卡托普利相比,具有降压效果温和特点。其降压机制可能是通过调节 ET和 NO间平衡状态,从而舒张血管,降低外周阻力,减少回心血量,达到降低血压效果。