2016, Vol. 35文章信息
- 郭茂娟, 索艳荣, 曾文赟, 杨琳, 李虎虎, 姜希娟
- GUO Mao-juan, SUO Yan-rong, ZENG Wen-yun, YANG Lin, LI Hu-hu, JIANG Xi-juan
- 银杏叶提取物EGB761对AS家兔PON-1和ox-LDL的影响
- Effects of EGB761 on PON-1 and ox-LDL in rabbits with atherosclerosis
- 天津中医药大学学报, 2016, 35(2): 95-98
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2016, 35(2): 95-98
- DOI: 10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.07
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文章历史
- 收稿日期: 2015-11-28
动脉粥样硬化（AS）是诸多心脑血管疾病的病理基础，而血脂紊乱，尤其是低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）的升高是形成AS的物质基础。当内皮细胞受损时，氧化应激增强，脂质过氧化，沉积于内膜下的LDL被氧化修饰成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），ox-LDL对内皮细胞具有细胞毒性作用，可损伤内皮，导致更多LDL沉积于内皮下，同时募集单核细胞侵入内皮并分化为巨噬细胞后吞噬ox-LDL，形成泡沫细胞，促进AS形成[1]。
对氧磷酶-1(PON-1)是一种由355个氨基酸组成的具有类似过氧化物酶活性的糖蛋白，广泛存在于哺乳动物的肝、脾、脑等组织及血液中，尤以肝及血液中的活性较高[2]。其主要由肝脏合成，分泌入血后与高密度脂蛋白（HDL）表面的apoA-I紧密结合，保护HDL免受氧化修饰[3]。同时PON-1亦可水解芳香族羧酸酯类及脂质过氧化物，使LDL免受氧化修饰[4]。现代研究表明PON-1第283位的Cys是发挥抗LDL氧化修饰的关键基团[5]。
EGB761是从银杏叶中分离纯化的提取物，其主要成分是24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯。近年来国内外研究均证实银杏叶提取物 EGB761具有明显抗AS效应[6, 7]，然而，其具体机制是否与调控PON-1活性及含量，进而抑制ox-LDL形成有关，还有待进一步深入研究。本文将从调控PON-1活性及含量入手，探讨EGB761降低ox-LDL含量以发挥抗AS作用。
1 材料和方法 1.1 药品、试剂和仪器银杏叶提取物（EGB761）（商品名：金纳多），由德国威玛舒培博士药厂生产，生产批号：9840808。PON-1活力检测试剂盒购置于上海钰博生物科技有限公司。PON-1酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒、ox-LDL ELISA检测试剂盒均购于上海雅吉生物科技有限公司。高脂饲料由2%胆固醇（购置于天津市英博生化试剂有限公司，含量纯度＞98%）、10%金龙鱼色拉油（市售）、88%普通饲料（由天津市武清区科达养殖中心提供）混合配成。仪器：离心机（CENCE L530），酶标仪（BIO-RAD）。
1.2 实验动物日本大耳白兔24只（购置于北京维通利华实验动物技术有限公司），雄性，体质量（2.4±0.2） kg，饲养于天津中医药大学清洁级实验动物中心。
1.3 实验分组及造模方法24只日本大耳白兔，于温度（28±2） ℃、湿度37%~48%的清洁级动物房适应性饲养1周后，随机分为3组：正常组（n＝8）给予普通兔饲料；模型组（n＝8）和EGB761组（n＝8）给予高脂饲料，自由饮水。
在高脂饲养6周后，EGB761组给予银杏叶提取物EGB76150 mg/（kg·d）灌胃4周，正常组和模型组则给予等量生理盐水。
1.4 样本的获取和处理10周后各组动物禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后，经耳缘静脉取血，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，置于-20 ℃冰箱冻存备用。
1.5 指标检测方法及步骤血清PON-1和ox-LDL含量的检测参照ELISA试剂盒说明书。PON-1酶活力的检测：以对氧磷为酶作用底物，依据酶学动力学原理，对其在405 nm处4 min内产物的生成速率进行连续监测，酶活性以每毫升血清每分钟生成产物对硝基酚的纳摩尔数表示1个PON-1酶活性单位值（单位U/mL）。
1.6 统计学方法采用SPSS19.0 软件进行统计分析，数据以均数±标准差（$\bar x$±ｓ）表示，采用单因素方差分析，组间比较使用LSD-t检验。以 P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 EGB761对PON-1含量和活性的影响见表1。
| 组别 | n | PON-1含量（ng/L） | PON-1 活性（U/mL） |
| 正常组 | 8 | 564.50±36.83 | 102.00±16.08 |
| 模型组 | 8 | 420.83±31.51** | 69.33±16.51** |
| EGB761组 | 8 | 506.67±42.55## | 88.67±9.03# |
| 注：与正常组相比**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0. 05，##P＜0.01。 | |||
由表1可以看出，与正常组相比模型组PON-1的含量和活性均明显降低（P＜0.01）；而EGB761组与模型组相比，PON-1的含量（P＜0.01）及活性（P＜0.05）明显提高。
2.2 EGB761对ox-LDL含量的影响见表2。
| 组别 | n | ox-LDL（ug/L） |
| 正常组 | 8 | 250.83±38.22 |
| 模型组 | 8 | 630.50±136.02** |
| EGB761组 | 8 | 480.83±51.31# |
| 注：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05。 | ||
以上结果说明，模型组的ox-LDL含量明显升高，与正常组相比具有显著性差异（P＜0.01）；而EGB761组与模型组相比，ox-LDL的含量明显降低（P＜0.05）。
3 讨论AS的形成是一个复杂的过程，血脂紊乱、氧化应激、内皮功能失调、慢性炎症反应等被认为是AS发生发展的重要因素。其中氧化应激参与并促进AS的发生、发展，在AS病程中发挥重要作用[8]。
流行病学调查显示，引起AS的关键是氧化修饰性脂蛋白，尤其是血液中的LDL被活性氧（ROS）等自由基氧化后形成 ox-LDL。ox-LDL作为氧化应激的特异性产物，在被氧化过程中，可以产生具有细胞毒性的溶血磷脂损伤内皮细胞，加速泡沫细胞形成，促进AS的病程进展[9]。
前期实验[10]发现EGB761可以改变AS家兔的动脉粥样斑块形态，而本实验研究发现经EGB761干预的AS家兔血清中的ox-LDL较模型组下调，提示EGB761可能通过干预LDL的氧化修饰防治AS。
PON-1具有过氧化物酶活性，血清中PON-1含量及活性的高低，反映了其抗脂质氧化的能力。血清中的PON-1与HDL上的ApoAⅠ具有很强的亲和力，两者结合后，可以使PON-1形成高稳定性和高活性的构型，从而使其内酯酶活性提高约20倍[11]。
这样一方面，使HDL免于氧化修饰，提高了胆固醇的逆向转运，另一方面，减少了LDL的氧化修饰，降低了溶血磷脂的产量，从而起到保护内皮，预防AS的目的[12]。相反，当AS发生时，PON-1的含量或活性下降，参与水解脂质过氧化的能力减弱，造成脂质过氧化物在血液中大量堆积，促进ox-LDL形成，后者损伤内皮，使脂质在内膜下大量沉积，进一步恶化AS[13]。
临床研究也证实血清PON-1活性下降和ox-LDL水平升高与冠心病的发生及病情严重程度密切相关[14]。而PON-1活性下降和含量降低是ox-LDL水平升高的关键影响因素。本实验结果显示经高脂诱导复制的家兔AS模型，PON-1的活性及含量明显降低，而经EGB761干预后，其活性与含量都显著提高，此结果与伍海涛[15]的研究结果基本一致。
现代临床和实验对银杏叶提取物保护神经元的研究颇多[16, 17, 18, 19] ，并主要集中在抗凋亡、抑制氧化应激等方面[20]。亦有研究从抗氧化损伤，抗炎症角度发现EGB761对AS具有防治作用[21, 22, 23]，但目前关于探讨EGB761在调节PON-1和ox-LDL两者之间关系上，很少有相关报道。
本实验采用EGB761干预高脂诱导的AS家兔模型发现其可以显著降低AS家兔血清中ox-LDL的含量，并上调PON-1的活性及含量。将ox-LDL与PON-1联系起来，提示EGB761可能通过上调PON-1酶的活性和含量，降低LDL的氧化修饰机率，从而降低ox-LDL水平，进而发挥抗AS的作用。
本文的研究结果只涉及到血清层面，并未涉及血管组织中ox-LDL的变化，以及具体的信号通路还有待进一步研究发现。
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