近年来，随着中国经济的发展，人们生活方式的转变，酗酒导致的酒精性肝病（ALD）的发病率迅猛增长，已经成为中国继病毒性肝炎之后常见导致肝脏疾病的又一大原因^[1]，严重危害人类健康，对ALD的发病机制也日益成为研究的热点^{[2, 3, 4]}。酒精性肝病初期通常表现为脂肪肝、酒精性肝炎，尤以脂肪肝最为突出^[5]，后期可发展为肝纤维化甚至肝硬化^[6]。

肝星状细胞（HSC）是肝内的贮脂细胞，正常情况下表现为富含脂滴的静止状态，当乙醇进入体内后，乙醛作为乙醇的直接代谢产物，是激活 HSC 并导致酒精性肝纤维化发生的关键分子^[7]。肝脏受损，HSC被活化，它的激活又是肝纤维化发生的中心环节^{[8, 9]}。其中酒精性肝纤维化（AHF）是肝硬化的必经阶段，由于此阶段的可逆状态，因此，预防和抑制其发生和发展引起广大医学者的重视。

葛根是传统解酒中药，而葛根素是主要活性成分，有研究表明，其有防治酒精性肝病的功效^{[10, 11]}。本文进一步探讨其防治酒精性肝纤维化的作用，并研究对HSC增殖活化的影响，从而深入探讨其发挥作用的可能机制，为临床应用和药物开发奠定理论基础和实验依据。

Wistar雄性大鼠85只，体质量200 g左右，SPF级，购自于中国人民解放军军事医学科学院，许可证号：SCXK－（军）2009-0003。

葛根素片（广州侨光制药有限公司），易善复[赛诺菲安万特（北京）制药有限公司]，62°牛栏山二锅头：北京顺鑫农业股份有限公司，吡唑：上海晶纯试剂有限公司，小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（PCNA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体、Sp-9002、DAB显色试剂盒、Masson三色染液均购自天津碧生源生物技术有限公司。

大鼠适应性饲养1周后按随机数字表法分为正常对照组10只、其他各组各15只。除正常对照组外，其他各组大鼠每日早晚2次予以62°二锅头酒10 mL/（kg·d）、玉米油2 mL/（kg·d）、吡唑25 mg/（kg·d）混合物灌胃^[12]，正常对照组则每日早晚予以相应剂量的生理盐水灌胃。葛根素低、中、高剂量组和阳性药对照组早晚灌胃之间分别给予葛根素片溶液6.25、13.5、27 mg/（kg·d）和易善复0.12 g/（kg·d）溶液灌胃，正常对照组和模型组给予相应剂量生理盐水灌胃。6组大鼠均饲以全价营养颗粒饲料，自由进食饮水。模型的制备时间为12周^[13]。

造模12周后，处死大鼠迅速剖腹取出肝脏，取各组大鼠肝右叶中间相同部分组织以4％甲醛溶液固定。

观察各组大鼠肝纤维化的情况，可见胶原纤维沿窦周隙延伸并伴有纤维结缔组织增生^[14]。Masson染色把肝组织中的纤维染成绿色，应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行分析,计算纤维所占面积的百分比。

采用免疫组化法（SP法）进行PCNA染色。PCNA阳性定位在肝细胞核，增殖细胞核呈棕黄色^[15]。观察不少于5个高倍视野（400倍），记数至少500个细胞。以增殖指数反映肝细胞增殖程度。

计算公式：增殖指数=PCNA阳性细胞数/细胞总数×100%

采用SP法进行染色。结果判定：阳性部位定位于胞浆，主要集中于肝脏组织汇管区，以纤维间隔中最为明显。于光镜高倍视野下，每张切片随机选取5个互不重叠视野，应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行分析，测定每个视野的阳性细胞面积，取其平均值。

统计学分析采用SPSS 18.0统计软件包进行，结果以均数±标准差（x±s）表示，各组数据比较采用方差分析方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

正常对照组大鼠一般情况良好，毛色光泽，精神活泼，至造模结束无死亡，模型组大鼠精神萎靡，嗜睡，体质量增长缓慢，体毛蓬乱，个别有脱毛现象。各给药组大鼠情况好于模型组。模型组、葛根素低、中、高剂量和阳性药对照组因灌胃乙醇呛入气管、慢性乙醇中毒等原因分别死亡7、8、7、8、8只大鼠。

正常对照组大鼠肝组织中肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，中央静脉周围未见纤维组织增生，门管区未见增宽。模型组大鼠肝组织中可见点状坏死，个别肝细胞发生脂肪变性。中央静脉周围可见少量纤维组织增生，门管区稍增宽，可见少量纤维穿插进入肝小叶。其他各给药组情况好于模型组。

模型组和各给药组大鼠肝组织纤维化面积均大于正常对照组，各给药组大鼠肝组织纤维化面积均小于模型组，但葛根素低剂量组要大于其他各给药组，葛根素中、高剂量和阳性药对照组大鼠肝组织纤维化面积没有显著差异，见表1。

模型组和各给药组大鼠肝组织增殖指数高于正常对照组，各给药组增殖指数低于模型组，但是葛根素中、高剂量和阳性药对照组增殖指数低于葛根素低剂量组，见表1。

模型组和各给药组大鼠肝组织α-SMA的表达高于正常对照组，葛根素中、高剂量组和阳性药对照组α-SMA的表达低于模型组，葛根素低剂量组α-SMA的表达和模型组差异无统计学意义，但从数据趋势上看低于模型组。见表1。

近年来，随着大量饮酒人员数量的增长，ALD已经成为高发的肝病之一。ALD中后期可逐渐出现肝纤维化，如果及时治疗，肝纤维化程度还可以减轻甚至逆转，但如果逐渐加重，就会发展为不可逆转的肝硬化，给患者带来极大痛苦甚至威胁生命，因此，如何减轻甚至逆转AHF是目前学者研究的一个重点^[16]。目前，学者发现乙醇可通过不同的机制可以造成肝损伤，致使肝细胞变性甚至死亡，肝细胞从再生能力讲属于稳定性细胞，生理状态下不进行再生，但当一部分肝细胞死亡后，其周围存活的肝细胞会展现强大的增殖能力，通过再生进行修复，弥补一部分肝细胞死亡给肝造成的损伤，因此可以通过检测肝细胞的增殖情况，间接揭示肝细胞的损伤程度。PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标^[17]。本研究通过检测大鼠肝细胞PCNA的表达，进而计算肝细胞增殖指数，来反映乙醇对大鼠肝组织的破坏程度。大量肝组织破坏，会通过不同机制促进间质纤维组织增生，但不管何种机制，最终殊途同归均是通过使HSC增殖活化，转变为肌成纤维细胞，进而产生纤维组织，从而发生肝纤维化^[18]。而α-SMA是HSC增殖活化的主要标志蛋白，与HSC活化的程度及数量呈正相关^{[19, 20]}。

中医没有AHF这个病名，多数学者认为酒精性肝纤维化的辨证应属于中医“酒癖”的范畴，《诸病源候论》曰：“酒性有毒，而复大热，饮之过多，故毒热气渗溢经络，浸溢腑脏，而生诸病也。”认为大量饮酒能够助生湿热之邪，长时间大剂量饮酒则使湿热酒毒内蕴，这是其主要发病病机。葛根为豆科植物野葛的根，其味辛、甘，性凉，入胃、脾二经，可以解酒醒脾，《本草正义》称葛根“最能开发脾胃清阳之气” ^[21]，自古以来，中医把葛根作为解酒毒的主要药物之一。葛根素为葛根的主要活性成分之一，现代医学发现其对ALD有防治功效^[10]，但对AHF的功效研究较少，具体发挥作用的机制更是不甚清楚。因此本实验进一步验证葛根素是否具有防治AHF化的功效，并以HSC活化为切入点，通过揭示葛根素对HSC增殖活化是否具有影响，进一步揭示其发挥作用的可能机制。

本研究发现，模型组和各给药组的大鼠肝纤维化程度显著高于正常对照组，而各给药组大鼠肝脏纤维化程度轻于模型组，低剂量组肝纤维化程度重于其他各给药组，而模型组增殖指数显著高于其他各组，葛根素中、高剂量和阳性药对照组增殖指数低于葛根素低剂量组，综上可以得出结论葛根素有防治酒精肝纤维化的功效，中、高剂量的效果要好于低剂量。实验结果进一步揭示模型组和其他各给药组α-SMA的表达均高于正常对照组，葛根素中、高剂量组α-SMA的表达低于模型组，葛根素低剂量组α-SMA的表达与模型组相比虽然没有显著性差异，但从数据趋势上仍然低于模型组。因此，葛根素可能通过抑制α-SMA的表达，从而抑制HSC的增殖活化，有效地延缓了AHF的发展进程，且以中、高剂量效果更加明显。而葛根素中、高剂量和阳性药对照组大鼠肝组织纤维化面积及α-SMA的表达没有显著差异，与阳性药防治效果相近，但由于葛根素的价格较低，毒副作用较少，亦可以考虑其作为治疗酒精性肝纤维化的常用药物，但其防治酒精性肝纤维化的深入机制还有待后续实验进一步研究。