乌梢蛇Ptyas dhumnades(Cantor,1842)在分类上属于蛇亚目（Serpentes）游蛇科（Colubridae）游蛇亚科（Colubrinae）鼠蛇属（Ptyas）。历史上，其异名包括Zaocys dhumnad（Cope，1860），Ablabes vittatus（Duméril,Bibron & Duméril,1854） 及Coluber dhumnades（Cantor，1842） 等，后被归入Ptyas属^[1-2]。本物种俗名中国鼠蛇（Chinese rat snake）、大眼鼠蛇（Big-eyed rat snake），或俗称过山刀。该物种主要分布于中国，生存于海拔50~1 570 m的区域，在河北、河南、山西、陕西、甘肃、四川、湖北、湖南、江西、江苏、福建、云南、贵州、广东、广西、台湾等省份均有发现^[3]。乌梢蛇属无毒蛇类，其分类除去内脏的干燥体，有祛风、通络、止痉的功效，常用于治疗风湿顽痹、抽搐痉挛、瘰疠恶疮等症^[4]。其分类特征包括头部鳞呈黑褐色，脊背耸立成屋脊状，背鳞有端窝两个，行数为偶数等^[5-6]。近年来，基于CYTB及CO1基因序列以及高特异性聚合酶链式反应（PCR）的乌梢蛇分子鉴定方法也得到建立与应用^[7-9]。

动物线粒体基因组包含了从分子序列到基因结构的全面信息，其基因组成排列相对保守，具母系遗传特征，且易于扩增测序^[10]，被广泛用于动物系统发育，以及种群保护等领域研究。蛇类的线粒体基因组编码2个rRNA、22个左右的tRNA和13个蛋白，1~2个非编码的控制区，并常包括1个轻链复制起始区。本文采用Ion torrent PGM二代测序技术^[11]，获得了乌梢蛇线粒体DNA全序列，此为国内外有关鼠蛇属动物线粒体基因组的首次公开报道。

1 材料与方法 1.1 动物

乌梢蛇购于福建福州，并经形态学及CO1基因分子鉴定。取新鲜肌肉组织立即使用。Voucher ID为wss-1。

1.2 总DNA提取

参照经典的酚氯仿抽提方法，获得总基因组DNA，并经A260/A280粗略估计浓度及纯度。

1.3 Ion Torrent PGM高通量测序 1.3.1 鸟枪法建库

鸟枪法是指将目的DNA随机打断成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。

1.3.2 OneTouch（油包水PCR）

每个微小磁珠通过接头连接相应的DNA片段，然后把含有DNA片段的磁珠和扩增试剂的溶液注入矿物油中，形成了油包水的小体系，使得每个小水滴只含一个磁珠，每个小水滴就是一个微反应体系。通过扩增，DNA片段可以增加几百万个拷贝，并且都连接在磁珠上。

1.3.3 ES富集

油包水PCR之后，加入Dynabeads^® MyOneTM Streptavidn C1 beads，它通过亲和素-生物素与带有双链模板的磁珠结合，最后加入氢氧化钠（NaOH）使得双链解链，制备单链模板。

1.3.4 PGM上机测序

将带有单链模板的磁珠、测序引物、DNA聚合酶混匀，离心使其进入318芯片的微孔中，然后上机测序。

1.4 序列拼接

从测序服务器上下载鸟枪法文库测序的原始数据至本地，预处理过滤掉低质量序列、过短序列以及错误序列，根据目的基因组大小（约16K bp），分割文件，调整合适的覆盖倍数（基因组大小的20X为佳），使用MIRA 4.0进行de novo拼接，结合近缘物种mapping组装，经反复迭代补全控制区（重复区）后，进行最高质量碱基合意，得到合意后的完整线粒体全基因组序列。

1.5 注释分析和提交

使用MITOS server线粒体在线注释系统^[12]，对全序列进行注释，结合tRNAscan-SE 1.21软件，进行tRNA定位。以游蛇亚科Elaphe anomala，Elaphe bimaculata，Oligodon ningshaanensis和Euprepiophis perlacea的线粒体基因组全序列为参照，对蛋白质编码基因、tRNA、rRNA及控制区等进行注释，L链复制起始区二级结构由RNA structure折叠生成。使用软件MEGA 4.0及Bioedit等统计序列总长、碱基组成和GC含量等。完整的乌梢蛇线粒体基因组全序列经Sequin注释后，提交GenBank，登录号为KR812112。

2 结果 2.1 序列拼接结果

获取乌梢蛇线粒体基因组后，经bowtie2比对^[13]，确认共189 977条序列（reads）可拼接至该基因组，序列平均长度214.4 bp，测序深度达1 958倍。

2.2 整体结构

乌梢蛇线粒体基因组结构见图 1、表 1。与大多数脊椎动物类似，乌梢蛇共编码37个基因，包括了22个tRNA，13个蛋白编码基因，2个rRNA（16S rRNA、12S rRNA）并有1个轻链（L链）复制起始区。其中除ND6和8个tRNA（Ala、Asn、Cys、Gln、Glu、Pro、Ser和Tyr）由L链编码，其余28个基因均由重链（H链）编码。其基因的排布顺序与大部分游蛇类动物相同。

2.3 碱基组成

乌梢蛇线粒体基因组全长17 162 bp，其中L链的碱基含量为：A=5 932 bp（34.6%），C=4 843 bp（28.2%），G=2 139 bp（12.5%），T=4 248 bp（24.8%），GC=6 982 bp（40.7%），A > C > T >G，AT% > GC%。且呈AT偏斜（0.165）和CG偏斜（0.387），这也与蛇类普遍情况相同。

2.4 蛋白编码基因

乌梢蛇线粒体基因组中蛋白编码基因全长11 267 bp，约占全基因组的65.65%。A=3 967 bp（35.2%），C=3 298 bp（29.3%），G=1 267 bp（11.2%），T=2 735 bp（24.3%），GC=4 565 bp（40.5%），A > C > T >G，AT% > GC%。所有蛋白编码基因无内含子。除ND1以ATA为起始密码子，ND2和ND3以ATT起始，CO1以GTG起始外，其余均使用ATG为起始密码子。除CO1以AGA为终止密码子，ND5和ND6以TAG终止，其余蛋白均使用T或TA碱基终止，并通过转录过程中3’端的poly A补全，形成完整终止密码子。氨基酸使用频率的分析见表 2。在一共3 747个氨基酸中，出现频率较低的为Cys（0.77%）、Asp（1.52%）和Arg（1.65%），而频率较高的为Leu（14.87%）和Thr（12.09%）。

2.5 rRNA和tRNA基因

乌梢蛇的12S rRNA和16S rRNA长度分别为921 bp和1 481 bp，GC含量分别为44.7%和40.2%。22个tRNA基因中，最短的为tRNA-Ser（anticodon=GCT，57 bp），最长的为tRNA-Leu（anticodon=TAA，73 bp）。大部分tRNA可折叠成三叶草二级结构，但tRNA-Ser（anticodon=GCT）折叠后缺失D臂，tRNA-Cys缺失TΨC环，见图 2。

2.6 非编码区

乌梢蛇的1号控制区（control region 1）位于tRNA-Pro与tRNA-Phe之间，2号控制区（control region 2）位于tRNA-Ile与tRNA-Leu（anticodon=TAA）之间，长度分别为1 025 bp和1 022 bp，比对后发现两者一致碱基为1 018 bp，一致率为99.5%。除控制区外，乌梢蛇线粒体基因组中有14 bp的6个非编码间隔区域，其中最长的间隔区为9 bp，位于ND6和tRNA-Glu之间，显示该物种线粒体基因组结构较为紧凑。

2.7 L链复制起始区

乌梢蛇基因组的L链复制起始区，长度为33 bp，可折叠成稳定的茎环结构，见于图 2C。其中茎由9对碱基组成，环为11个碱基。

3 讨论

线粒体全基因组测序方法，在以往多基于PCR技术^[14]，该方法需根据目标物种的近缘物种，设计合适引物，进行普通PCR或Long-PCR（ > 4 kb），并对扩增产物进行测序或步移测序。而近年来，随着高通量测序技术的成熟，测序成本的大幅下降，更多的目光集中在利用总基因组DNA测序结果，从中筛选拼接线粒体基因组序列^[15-17]。本实验即采取后者策略，建立了基于高通量测序结果的线粒体基因组拼接工作流程。此方法可快速、低成本的得到目标物种的高深度线粒体基因组，并避免PCR过程中产生的碱基错配可能。

在系统发育学研究中，线粒体中蛋白编码区以及tRNA区的结构变化应用较多。而另一方面，控制区（重复区）序列由于受进化压力较小，其碱基替换速率较快，这对药用动物的种下研究尤有意义。与其他真蛇类动物类似，本研究同样在结构紧凑的线粒体基因组中，发现了两个控制区序列，其形成原因尚无定论。但已有研究发现，蛇类中这两个控制区在同一物种内相似度很高，而不同的物种间又有较大的分歧。这提示了其可能是协同进化的结果^[18]。

中药资源的研究是目前中药研究的热点问题，较多的工作集中在药用植物上^[19-20]，而动物上开展较少。通过线粒体基因组数据的累积，研究以上双控制区序列在种内（种群间）的变化，也可作为研究药用蛇类种群分化的分子标记，为药用蛇类的资源普查及保护提供参考。