地锦草为大戟科植物地锦（Euphorbia humifusa Willd.）或斑地锦（Euphorbia maculate L.）的干燥全草，分布于全国各地，具有清热解毒、利湿退黄、活血止血的功效，临床上主要治疗细菌性痢疾、肠炎、痈肿疔疮和湿热黄疸等^[1-2]。地锦草中化学成分主要是没食子酸、鞣花酸等有机酸类和槲皮素、山奈酚等黄酮类化合物^[3-8]，其中没食子酸具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等活性^[9]，鞣花酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变等活性^[10]，槲皮素、山奈酚均具有抗炎、抗氧化、抗菌等活性^[11-12]。中国药典以槲皮素作为地锦草的质控指标，同时有文献采用高效液相色谱法（HPLC）测定地锦草中成分^[13-15]，但对其多指标成分的测定较少报道。超高效液相色谱法（UPLC）测定具有方法简便，分析时间短，溶剂消耗少等特点，尤其适用于中药材多指标成分的定量检测。本研究采用UPLC技术^[16-20]，建立了UPLC法测定地锦草中没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚含量的方法，更加全面的控制地锦草药材的质量，对地锦草制剂开发及质量控制提供可靠依据。

1 仪器与材料

Waters Acquity超高效液相色谱仪，配置四元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱、TUV检测器，美国Waters公司；Sorvall ST16R高速离心机，德国Thermo Scientific公司；Milli-Q超纯水机，德国Millipore公司；KQ-300B超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；Mettler Toledo XP205电子分析天平，Mettler Toledo仪器有限公司；FA124型天平，上海舜宇恒平有限公司。

没食子酸（批号110831-201204）、槲皮素（批号100080-201408）对照品由中国食品药品检定研究院提供；鞣花酸（批号W16-5-0）、山奈酚（批号W13-5-9）对照品由天津中新药业有限公司提供，质量分数均≥98%。甲醇、乙腈均为色谱纯，Fisher Scientific公司；水为超纯水；甲酸为色谱纯，购自日本东京化成工业株式分社。地锦草药材分别收集于贵州、河南、安徽、广西等产地，共12批，经天津中医药大学中医药研究院刘志东博士鉴定为大戟科植物地锦（Euphorbia humifusa Willd.）的干燥全草。药材信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱为Acquity UPLC BEH C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），检测波长为0~4 min，270 nm，4~55 min，360 nm；柱温30 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量为2 μL；流动相为甲醇:乙腈4:6（A）-0.2 %甲酸水（B）进行梯度洗脱，洗脱程序见表 2。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚对照品适量，加甲醇制成浓度分别为:412.0、608.0、200.0、10.0 mg/L混合对照品储备液。分别精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.6、2.0 mL储备液置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得系列混合对照品溶液，避光保存。

2.2.2 供试品溶液的制备

称取地锦草粉末（过三号筛）2.0 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称质量，超声处理45 min （频率40 KHz，功率300 W），放冷、称质量，加80%甲醇补足减失的质量，摇匀，12 000 r/min离心10 min，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3 系统适应性实验

分别精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液2 μL，按“2.1”项色谱条件进样，结果4种被测成分均能达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰计均超过10 000，峰形较好。UPLC色谱图见图 1。

2.4 线性关系考察

在“2.1”项色谱条件下，分别精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别按照色谱条件依次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程。结果见表 3。

2.5 精密度实验

取混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，进样体积为2 μL，以对照品峰面积进行计算，没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.66%、0.55%、0.80%、1.39%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取待测地锦草（编号S2）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚的峰面积，按峰面积计算得RSD分别为0.80%、0.97%、1.18%、1.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性实验

取同一批次地锦草药材粉末（编号S2）约2.0 g，平行称定6份，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液6份，每份精密吸取2 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，分别测得没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚质量分数的RSD分别为1.80%、1.40%、1.76%、1.21%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验

取已测定的地锦草药材（编号S2）粉末6份，每份1.0 g，精密称定，每份加入相同量的没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚对照品，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定，结果平均回收率分别为96.5%、102.9%、96.9%、97.0%，RSD分别为1.34%、1.22%、0.91%、1.30%。

2.9 样品测定

取收集于贵州、河南、安徽、广西等不同产地的12批地锦草药材，分别称取地锦草药材粉末约2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，平行3份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并计算样品中4种指标成分的含量，结果见表 4。

结果表明，贵州、河南、安徽、广西产地12批次的地锦草药材中4种指标成分的含量存在一定差异，其中没食子酸含量差异较大，以广西产的含量最高，这可能与土壤、环境、采收季节、加工过程等有关。

3 讨论

本实验考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇:乙腈（4:6）-0.1%甲酸水混合溶剂系统对地锦草成分分离度的影响，结果发现甲醇:乙腈（4:6）-0.1%甲酸水混合溶剂系统能够使色谱峰达到完全分离。同时考察了甲酸用量对色谱峰对称性的影响，结果发现，0.2%甲酸水溶液对色谱峰对称性较好，且甲酸易挥发的性质适用于UPLC的测定，故最终确定甲醇:乙腈（4:6）-0.2%甲酸水溶液作为流动相。

在样品处理过程中，考察了甲醇、80%甲醇、50%甲醇3种溶剂的提取效率，结果表明80%甲醇作为提取溶剂时，各指标成分的含量较高，故选择80%甲醇作为提取溶剂。

超声提取各成分，考察了30、45、60 min超声时间的提取效果，发现超声30 min时各成分的含量相对较低；45 min和60 min各成分的含量基本一致，故提取时间选择45 min。

测定波长的选择上，没食子酸的最大吸收为270 nm，鞣花酸、槲皮素、山奈酚均在360 nm时有强吸收，并且基线平稳，故确定其测定波长为0~4 min时波长为270 nm，4~55 min时波长为360 nm。

《中国药典》2015年版采用酸水解的方法对地锦草中黄酮苷进行降解，测定降解产物槲皮素的含量；而本实验采用有机溶剂直接提取药材中的有效成分进行含量测定，更能准确反映各指标成分在药材中的真实含量。

本实验建立了UPLC法测定地锦草中4种指标成分的方法，分析了4个产地12批药材中有机酸和黄酮类成分的含量，黄酮类成分含量地域差异较小，而有机酸类成分含量差异较大，为地锦草药材的质量控制提供了科学依据。