芪参益气滴丸由黄芪､丹参､三七和降香组成,具有益气通脉､活血､止痛的功效,用于治疗胸痹心痛,属于现代医学的冠心病心绞痛范畴。有研究报道芪参益气浸膏和提取溶液给药4周可改善心肌梗死大鼠心功能､缩小梗死面积､促进梗死周边区血管新生^[1-2]。促血管新生治疗后,缺血区新生血管密度增加､梗死面积减小,心肌细胞坏死和凋亡的程度降低､射血分数增加､心功能得以改善^[3-4]。为进一步探讨芪参益气滴丸促进血管新生的作用及其作用特点,笔者动态观察芪参益气滴丸对体外培养大鼠主动脉环不同时间点新生血管的总长度､总分支数､平均长度和最长长度,以期阐述该药对血管新生的速度及维持时间的影响,明确其作用特点。

1 实验材料

10*MEM培养基:Gibco,批号1268317;MCDB131: Gibco,批号1644017;1640培养基:Hyclone,批号NXC0596;重组人血管内皮生长因子(VEGF):Millipore,批号2301935;鼠尾胶:SERVA,批号:131254-2。芪参益气滴丸:天津天士力制药集团股份有限公司,批号150208。

2 实验方法 2.1 血管段培养及鉴定

参照文献^[5]标准。冰浴中按以下比例配制鼠尾胶工作液:2 g/L鼠尾胶750 μL､10*MEM 100 μL､1.4%碳酸氢钠(NaHCO₃)150 μL､混匀,以1 mol/L氢氧化钠(NaOH)适量(约10 μL)调节pH值至7.4,混匀。将配制好的工作液冰浴静置30 min,48孔板每孔加鼠尾胶工作液200 μL,培养箱内放置30 min待其凝胶,备用^[5]。

取100 g SD大鼠,脱臼处死,75%乙醇浸泡消毒,无菌取出胸主动脉,于无菌含1640培养基的培养皿中剥离血管周围结缔组织,冲出管腔内血液,将主动脉切为2~3 mm长的动脉环,1640培养基洗5遍。将主动脉环以管腔平行于培养板底面置于上述备好的48孔板内的凝胶上,在其上再加200 μL鼠尾胶工作液,培养箱内放置30 min,凝胶后,加入培养基培养。每隔2 d换液1次。在新生血管生长最佳时,去除主动脉环,将三维培养物用家兔凝血块包埋,将此包埋物沿血管环纵轴常规石蜡切片,CD31免疫组织化学染色鉴定。

2.2 芪参益气滴丸对培养血管段血管新生及稳定的影响

将三维培养物分为正常组(正常培养基:含1%PS､2 mmol/L L-谷氨酰胺､1% 1.1 mol/L NaHCO₃ 的MCDB131)､VEGF组(含10 μg/L VEGF的正常培养基)､芪参益气滴丸组(含25 mg/L芪参益气滴丸的正常培养基,简称QS组)､VEGF+芪参益气滴丸组(含10 μg/L VEGF+25 mg/L芪参益气滴丸的正常培养基,简称VEGF+QS组),每组3复孔。每3 d换液1次。从第3天开始,倒置非相差显微镜照像,隔天计数新生血管的总分支数､总长度､平均长度､最长血管长度^[5],直至新生血管退化,比较各组对血管新生及稳定的影响。

2.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理,所有数据用均数±标准差(x±s)表示。重复测量资料间比较采用重复测量方差分析,P<＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果 3.1 大鼠主动脉环三维培养物新生血管鉴定

于主动脉环三维培养物培养第5天,CD31免疫组织化学染色鉴定,结果表明长出的管样结构主要由内皮细胞组成,其中心具有管腔样结构,表明新生的管样结构为新生血管,见图 1。

3.2 芪参益气滴丸对大鼠主动脉环三维培养物血管新生与稳定的影响

正常培养第1天,可见有细胞从主动脉环横断面长出,呈散在生长,未见有明显新生血管样结构;第2天,有少量管样结构长出;第3天,可见大量新生血管,较第2天明显增长;第3~7天总分支数无明显变化,而总长度､平均长度､最长长度持续增加;第 9天总分支数､总长度下降,平均长度､最长长度仍持续增加,新生血管逐渐增粗;第11~15天总分支数､总长度下降,平均长度､最长长度无明显变化,镜下管样结构逐渐崩解。表明培养前3 d为血管发芽期,5~7 d主要表现为血管长度增加,第9天开始血管增粗,但也开始退化,此后血管迅速退化。

主动脉环培养前3 d为血管出芽阶段。在第3天,VEGF+芪参益气滴丸组和芪参益气滴丸组与正常组比较总分支数明显升高(P<0.05),VEGF组较正常组有增加趋势但无统计学差异;芪参益气滴丸组总长度､平均长度､最长长度明显高于正常,VEGF+芪参益气滴丸组和VEGF组有增加趋势但无统计学差异,表明在此阶段各用药组均能促进新生血管发芽,但以芪参益气滴丸作用最强。

第3~7天为新生血管生长阶段。与正常组比较,各用药组均有增加新生血管总分支数､总长度､平均长度､最长长度的趋势,各组差别不明显。

第7天之后,新生血管逐渐进入增粗､形成管腔,逐渐成熟和退化阶段。与正常组比较,VEGF､芪参益气滴丸､VEGF+芪参益气滴丸组第7~15天均有增加新生血管总分支数(除芪参益气滴丸第13天､第15天外)､总长度､平均长度､最长长度的趋势,其中部分时间点与正常组比较差异有统计学意义。从各指标的变化规律来看,VEGF组的新生血管数量和长度第7~15天维持在较高水平,未再明显增加,镜下观察第9天新生血管明显增粗,11 d后虽新生血管数量和长度无明显变化,但管样结构逐渐崩解,退化,此后退化更明显。芪参益气滴丸组7 d后血管数量和总长度迅速降低,镜下观察变化规律与正常组相似。VEGF+芪参益气滴丸在7~13 d维持血管数量无明显变化的同时,可支持血管持续生长,使其总长度､平均长度､最长长度逐渐增加,第15天血管数量虽未明显降低,但最长长度降低,镜下观察,第7天新生血管明显增粗,第11天可见管腔样结构,此后新生血管有退化现象,但较其他组退化减慢并可见有新的血管芽长出。

以上结果表明,25 mg/L芪参益气滴丸､10 μg/L VEGF､10 μg/L VEGF+25 mg/L芪参益气滴丸均能促进体外三维培养的大鼠主动脉环血管新生。其中芪参益气滴丸､VEGF､VEGF+芪参益气滴丸均能促进培养血管环早期(1~3 d)新生血管发芽及持续生长(3~7 d)。但7 d后,单纯应用芪参益气滴丸则血管迅速退化;单纯用VEGF血管数量和长度不再明显增加,且新生血管结构在第11天明显破坏,新生血管逐步退化;VEGF+芪参益气滴丸合用能使7~13 d新生血管持续稳定生长,并延缓其退化。见表 1~4,图 2。

4 讨论

正常生理状态下,内皮细胞更新率很低,血管细胞,特别是内皮细胞表面上虽然并不活跃,但它们的物质代谢相当活跃,它们产生细胞因子､黏附分子､生长因子､血管活性肽,对先天及细胞免疫､器官和组织修复､心血管､肺､肾功能均有影响。在生理､病理刺激,比如当心肌梗死､缺血缺氧等发生时,内皮细胞能很快的被诱导复制^[6],形成新生血管。但是,新生血管数量少及新生血管结构和功能的异常是许多缺血性疾病如心肌梗死､退行性黄斑病变和糖尿病下肢缺血坏死等的共同的病理特点^[7-8]。治疗性的血管发生是以可控的手段目的性的给与相关生长因子和基因以促进具有生理功能的新生血管形成。

芪参益气滴丸临床主要用于治疗胸痹心痛,属现代医学的冠心病心绞痛范畴。Zhang等^[2]通过结扎大鼠冠状动脉前降支建立心肌梗死模型发现,芪参益气滴丸能提高左心室心肌 VEGF､成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF-B)的 mRNA 和蛋白水平,促进血管新生,减少心梗面积。周钧等^[9]发现芪参益气浸膏能动员急性心肌梗死大鼠内皮祖细胞进入外周血循环使其数量增加并促进梗死周边区血管新生,限制梗死面积。

为进一步探讨芪参益气滴丸促进血管新生的特点,通过对体外三维培养的大鼠主动脉环,加入VEGF､芪参益气滴丸､芪参益气滴丸合并VEGF,对血管新生及其维持时间进行了动态观察,结果表明:芪参益气滴丸与VEGF的早期促发芽和其后的一段时间维持新生血管生长的作用相似。但作用7 d后,单纯应用芪参益气滴丸并不能长久维持新生血管的稳定生长,但若与VEGF合用,则具有协同作用,能够促进新生血管的持久稳定,且可见管腔样结构。在心肌梗死等缺血性疾病,病灶部位本身存在VEGF升高,推测给予芪参益气滴丸有和VEGF协同,促进血管新生及稳定的作用。这也与现有研究芪参益气滴丸能促进在体血管新生,减小梗死面积的研究结果相似。

综上所述,芪参益气滴丸能促进三维培养主动脉环血管新生,但维持时间较短,与VEGF合用有协同作用,可促进血管新生,维持持续生长较长时间,并延缓新生血管退化。

目前对于血管新生的机制的研究主要包括VEGF､bFGF/PDGF-BB/PDGFR-α､β通路､转化生长因子(TGF-β)通路､Ang1-Tie2通路等方面^[10-13],笔者正在对体外三维培养不同时间点芪参益气滴丸对这些通路的影响进行检测,以期探讨芪参益气滴丸上述促进血管新生及稳定的机制。