淫羊藿苷（IT）为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体成分。药理研究表明,Icariin在体外具有促进成骨细胞活性,抑制破骨细胞活性的作用，对于骨损伤后的修复能起到重要作用^[1-2]。羟基磷灰石[Ca₁₀（PO₄）₆（OH）₂，HAP]是人体骨组织的主要成分，有很好的生物相容性和骨导向作用，由于羟基磷灰石能吸附化学药物小分子和蛋白质等生物大分子，非常适合作为药物载体^[3]。卡波姆是聚烷基蔗糖或聚烷基季戊四醇与丙烯酸交联聚合物的共聚物，在很低的浓度下即能够形成有生物黏附性的高黏度的凝胶，以卡波姆为基质的凝胶剂具有释药快、易涂展、无油腻性对皮肤和黏膜无刺激性的优点^[4-5]。文章以卡波姆为基质，制备了Icariin/HAP纳米凝胶剂，并考察其体外释放特性，为临床骨修复制剂提供参考。

1 仪器与材料

TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；THZ-82水浴恒温振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；FA₂004A电子天平（万分之一）（上海精天电子仪器有限公司）；Sartorious BT125D 分析天平（十万分之一）（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；透析袋（MD34，8000-14000，北京Solarbio科技有限公司）；透析袋夹子（北京Solarbio科技有限公司）。淫羊藿苷（批号HK20091018，纯度>98%，陕西慧科植物开发有限公司）；HAP（平均粒径30 nm，惠州市可莱纳米新材料有限公司）；六偏磷酸钠（NaP，分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）；三乙醇胺（分析纯，天津市化学试剂供销公司）；丙二醇（分析纯，天津市化学试剂批发公司）；CARBOPOL·980 NFPolymer（产地美国Lubrizol，北京凤礼精求商贸有限责任公司）；纯净水（天津娃哈哈桶装水有限公司）。

2 实验方法 2.1 线性关系考察

精密称取5 mg Icariin于25 mL容量瓶中用甲醇定容，得0.2 g/L Icariin甲醇溶液作为母液。分别精密量取0.05、0.1、0.25、0.5、0.75 mL上述Icariin甲醇溶液于10 mL容量瓶中用甲醇定容，得浓度为1、2、5、10、15 mg/L的系列标准液，于270 nm波长处测定吸光度（A)，以吸光度（A）为纵坐标，Icariin 浓度（C）为横坐标进行线性回归，计算标准曲线，用以测定Icariin的含量。

2.2 Icariin/HAP纳米混悬液的制备

采用混合超声载药法制备Icariin/HAP纳米混悬液。将NaP 0.312 5 g，HAP 0.025 g 分散于50 mL 蒸馏水中，超声10 min，加入Icariin/乙醇溶液25 mL（Icariin浓度为0.18 g/L）继续超声50 min，旋转蒸发挥去部分溶剂，得Icariin/HAP纳米混悬液。

2.3 Icariin/HAP纳米混悬液载药量、吸附率的测定

按“2.2项”的Icariin/HAP纳米混悬液制备方法制备混悬液（药物投加量4.5 mg，超声时间1 h）。取Icariin/HAP纳米混悬液1.5 mL于离心管，12 000 r/min，离心10 miｎ，取上清液1 mL稀释3倍，以同法制备的空白HAP纳米混悬液为参比，270 nm测定吸光度（n=3），求得游离药物浓度。按以下公式计算载药量和吸附率^[6]：载药量=载入药物量/（载入药物量+HAP用量）×100%。吸附率=（总药物量-游离药物量）/总药物量×100%。

2.4 空白凝胶剂的制备

采用研和法制备空白凝胶。称取一定量的卡波姆980于烧杯中，加入少量蒸馏水放置过夜，使之溶胀，溶解。滴加三乙醇胺适量调节pH值在6~7之间,得无色透明的空白凝胶基质。

2.5 Icariin/HAP纳米凝胶剂的制备

称取一定量的卡波姆980于烧杯中,加入30 mL蒸馏水放置过夜,使之溶胀,溶解。滴加三乙醇胺适量调节pH值在6~7之间，得无色透明的空白凝胶基质。将30 mL Icariin/HAP纳米混悬液与空白凝胶基质研和均匀，得Icariin/HAP纳米凝胶。

2.6 Icariin/HAP纳米凝胶剂的体外释放

选用透析袋（截留分子量8 000～14 000），于使用前在超纯水中煮沸0.5 h。药物释放介质为生理盐水。取 4 g Icariin/HAP纳米凝胶剂、Icariin凝胶剂、Icariin溶液加入透析袋中，用透析袋夹夹紧两端，将透析袋置于装有50 mL 释放介质的烧杯中，封口膜封住，释放介质温度控制在（37±0.5） ℃，于恒温水浴摇床低速震荡，于 1，3，5，8，23 h 取样 3 mL，迅速补充同温度释放介质3 mL，以释放介质为参比，用 UV 法分析，测试其浓度，计算药物不同时间的累积释放量，以累积释药率对释药时间作图（n=6）^[7]。

3 实验结果 3.1 Icariin的测定

Icariin在波长270 nm处有最大吸收,而且制剂中其它成分对Icariin的测定没有影响。线性回归方程为A=38.512C-0.015 9，r=0.999 9。表明Icariin在1~15 mg/L线性关系良好。对于Icariin/HAP纳米凝胶中药物的释放,可采用生理盐水为释放介质,Icariin在生理盐水中有一定的溶解度,能够满足测定所需的漏槽条件。

3.2 Icariin/HAP纳米混悬液载药量、吸附率的测定结果

见表 1。

3.3 Icariin/HAP纳米凝胶剂处方优化

采用正交设计优化Icariin/HAP纳米凝胶剂的处方配比。以基质中卡波姆980、三乙醇胺和丙二醇的用量为影响凝胶剂质量的主要因素，每个因素取3个水平，见表 2，采用L9（34）正交试验表设计试验^[8-10]。以透明度、成型性、涂展性、变色时间为指标进行综合评分，上述4个指标各占2.5分，满分10分，每个指标按优、良、中、差评分，具体评分标准见表 3。

从直观分析知各因素对综合评分的影响大小顺序为：A（卡波姆－980）>B（三乙醇胺）>C（丙二醇）；每个因素3个水平间的趋势为A₂>A₃>A₁，B₃>B₂>B1，C₁>C₃>C₂，直观分析得处方配比为A₂B₃C₁，即基质中卡波姆浓度为1％，三乙醇胺用量为1．5％，丙二醇用量为5％，见表 4。方差分析结果表明，A因素的影响具有统计学意义（P<0.05）,B和C的影响不显著（P>0.05）。因此时Icariin/HAP纳米凝胶剂的pH值为6.5，故将其处方中的pH确定为6~7，见表 5。

3.4 体外释放结果

见图 1。

将Icariin溶液、Icariin凝胶剂、Icariin/HAP纳米凝胶剂的体外累计释药曲线分别按零级、一级、Hiquchi 和Weibull方程拟和^[11-12]，结果见表 6～8。r越接近1,AIC值越小拟合效果越好。3种剂型Icariin/HAP纳米凝胶剂、Icariin凝胶剂和Icariin溶液体外释放曲线均符合一级模型和Weibull模型。

4 讨论

在纳米混悬液的制备中，为防止HAP纳米粒子的聚集，预实验对多种分散剂NaP、聚丙烯酸钠、柠檬酸钠、羧甲基纤维素钠进行了筛选^[13-15]，最终选择了分散性及稳定性最好的NaP作为分散剂。测得载药纳米粒子粒径为（472.4 ±2.86） nm，电位为-（62.7±1.31） mV。在载药量、吸附率的测定结果中，因Icariin/HAP纳米混悬液是通过物理吸附载药，仅是表面吸附，因此为吸附率而不是包封率。

Icariin/HAP纳米凝胶剂以卡波姆为基质，卡波姆在酸性条件下可溶于水形成溶液，当pH值升高时溶液黏度迅速增大，pH值为6~12时最大。预实验对卡波姆不同型号Carbopol 980、Carbopol 934P、Carbopol 981进行了筛选，最终选择透明度及成型性均较好的Carbopol 980作为基质。由于Icariin/HAP纳米混悬液中加入了较高浓度的电解质六偏磷酸钠，根据文献参考^[16-18]，电解质对卡波姆凝胶黏度影响较大，故本实验中通过增大卡波姆的用量来抵消离子引起的黏度损失。pH值调节剂是用来调节凝胶基质的酸减度，使其黏度增加，浑浊度降低。常用的碱有氢氧化纳及三乙醇胺。考虑到氢氧化纳的碱性过强，稍过量则会导致碱性过强，使基质的黏度下降，且生成的无机盐会破坏胶体体系。而三乙醇胺属于胺类有机碱，碱性较弱，pH值不会大幅度增加。故以三乙醇胺作为Carbopol980的pH值调节剂。常用保湿剂有丙二醇、甘油，因丙二醇毒性和皮肤刺激性均较甘油小，故选丙二醇为保湿剂。本实验中乙醇既作为主药Icariin的溶剂，又有防腐的作用，出于安全性考虑，未添加其他防腐剂。

体外释放实验中，在种制剂均符合一级模型和Weibull模型，因纳米HAP是通过物理吸附载药，释药快。但在动物体内的相关特性还有待进一步研究。