表观遗传学表现为DNA甲基化谱、基因表达谱和染色质结构状态在细胞间传递的遗传现象而不涉及DNA序列变化的一门科学。DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA是常见的表观遗传学研究内容,其中DNA甲基化在基因表达、基因组印记、染色体稳定性和胚胎发育等方面均扮演重要角色^[1],因此研究最为广泛。DNA甲基化被认为是继基因突变、缺失这两种机制后,导致抑癌基因失活的第三种机制,是肿瘤中最常见的分子改变之一。

大肠癌包括结肠癌与直肠癌,是常见的恶性肿瘤,其发生率越来越高,已高居世界恶性肿瘤第3位,病死率第4位。故早期发现、诊治对于大肠癌患者延长生命和提高生活质量具有重要意义。大肠癌的发生与基因突变、异常甲基化等密切相关,是多重因素和步骤共同作用的结果。基因为了保护DNA 特定位点不受特定酶的影响而降解,会在特定条件的刺激下发生甲基化,目的是进一步调节基因表达,此反应是可逆的,是肿瘤发生的早期事件^[2-3]。

1 抑癌基因的异常甲基化 1.1 APC

APC是位于人第5号染色体的抑癌基因,其突变在遗传性结肠癌中至关重要。有研究发现^[4-5],在转基因小鼠多发性结肠腺瘤发展早期,APC基因甲基化起着决定性的作用,甲基转移酶活性的降低,可减少腺瘤的发生率。APC基因启动子部位的高甲基化能导致基因失活、不表达或过表达蛋白从而增加肿瘤发生的几率。许多研究已证实人类大肠癌发生的早期是由于Wnt信号转导途径失调,而在Wnt信号通路中起到了关键的抑制作用正是APC基因,其启动子区域的甲基化导致抑癌基因的完全失活,直接激活了Wnt通路从而促进FAP的发生,最后导致大肠癌的发生。

1.2 P16

抑癌基因P16位于人第9号染色体,其与细胞增殖,细胞周期加速密切相关,导致肿瘤的发生。近年来,基因启动子区的高甲基化引起的肿瘤抑制基因表达下调逐步发展为肿瘤研究的焦点之一^[6],而甲基化所引起的P16基因沉默是人类肿瘤中较常发生的基因改变。Kim等^[7]运用MSP法检测45例HP P16基因启动子区甲基化的情况,结果甲基化率达到60%。葛畅等^[8]研究发现,大肠癌组织的甲基化率明显高于正常黏膜组织、TA、HP、SSA/P和TSA。P16基因甲基化可能导致P16蛋白表达下调,推动锯齿状通路,是大肠癌发生的重要分子事件。Wani等^[9]也通过实验检测大肠癌患者最后得出了相同的结论。

1.3 RUNX3

RUNX3基因位于人类染色体1p36.1上,含有6个外显子、两个启动子p1和p2和1290 kb 的开放阅读框。RUNX3基因是1994年首次发现并逐渐被关注的抑癌基因^[10],在调控细胞周期、分化与凋亡过程中发挥重要作用。Shima等^[11]研究发现RUNX3是一种抑癌基因,其启动子的高甲基化,导致结肠上皮细胞增生和分化的平衡失调,出现过度增生和分化异常,进而导致结肠肿瘤的发生^[12]。Subramaniam等人研究得出RUNX3启动子的异常甲基化致相应表达下调,是结直肠锯齿状腺瘤恶变过程中的一个早期事件,并可作为一种有效的分子靶标应用于临床检测^[13]。何绍亚等^[14]研究提示Runx3基因CpG岛甲基化可能发生于正常结肠黏膜到结肠腺癌这一发展过程的早期阶段,是结肠癌发生的早期分子事件。

1.4 NDRG2

NDRG2基因染色体位于14q11.2,是与肿瘤细胞增殖、分化密切相关的抑癌基因。Jeschke等^[15]研究显示正常结肠组织内未见NDRG2基因甲基化,在早期大肠癌组织中,检测到27%发生超甲基化,晚期大肠癌中则更为显著。Li等^[16]应用MSP方法评价30例大肠癌的肿瘤组织中NDRG2的甲基化状态,发现组织中NDRG2超甲基化,且晚期大肠癌较早期大肠癌更为显著,而正常结肠组织却未见甲基化,可见其与肿瘤的发生发展有着密切关系。Feng等^[17]通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)分析,发现大肠癌中NDRG2表达下降,启动子发生重新甲基化。说明NDRG2的表达受启动子甲基化的调控。

1.5 PAQR3

PAQR3又名PKTG,作为抑癌基因,能负性调控 Ra/Raf/MEK/ERK等信号通路,影响能量代谢、细胞分裂增殖、分化以及生殖细胞成熟等过程。PAQR3基因沉默的机制尚不清楚,可通过检测大肠癌组织中基因启动子甲基化水平,来探讨它们之间的关系。Lilly Crop等^[18]研究显示,PAQR3在大肠癌组织中的表达低于正常组织,甲基化物异性聚合酶链反应(MSP)法分析显示,在大肠癌组织中PAQR3发生甲基化的概率为33.3%。PAQR3沉默导致其甲基化水平增高,与分期、分化程度、有无淋巴结转移有关。年龄越大、分化程度越低、分期越高、淋巴结发生转移者,PAQR3基因启动子甲基化水平越高;反之,PAQR3 基因启动子甲基化水平越低^[19]。

1.6 SYK

脾酪氨酸激酶(SYK)编码蛋白是一种非受体型蛋白质酪氨酸激酶,定位于人类染色体9q22区,它可以促进细胞的增殖、分化,调节多种重要信号传导途径^[20]。SYK基因表达的缺失会导致机体免疫下降,无法及时有效的清除异常增生与突变的细胞,从而导致肿瘤的发生。彭星宇等^[21]研究中,55例直肠癌组织syk基因启动子甲基化发生率明显高于对应癌旁正常组织,其启动子高甲基化导致直肠癌细胞的侵袭和转移能力增强,从而增加了直肠癌淋巴结转移的可能性,使肿瘤进展更快。

1.7 ANKRD18B

张明谦等^[22]发现ANKRD18B基因在大肠癌细胞株SW480和HT29中,高甲基化最为明显^[23],提示该基因可能与大肠癌的发生密切相关。该基因是通过高甲基化失活,从而参与肿瘤的发生。此外,该研究还观察到ANKRD18B基因甲基化与大肠癌临床分期关系密切,表明该基因甲基化在大肠癌发展中起着重要作用,提示 ANKRD18B基因可能为一个抑癌基因。

2 原癌基因的异常甲基化 2.1 C-myc

原癌基因C-myc能够调控细胞增殖或分化,与细胞生长分裂密切相关,过度表达可诱导细胞转化与肿瘤形成,低甲基化可引起C-myc基因活化,参与肿瘤的发生^[24]。罗瑾等^[25]选用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)处理大肠癌细胞系HT-29,使其癌基因C-myc启动子区域甲基化,发现细胞生长受到明显抑制,C-myc蛋白表达明显降低。

2.2 COX-2

COX是前列腺素(PG)合成过程中的限速酶,有COX-1和COX-2两种同工酶,其中COX-2与肿瘤的增殖、凋亡及转移密切相关。它可以增加肿瘤的转移和侵袭、提高细胞的生存能力、抑制凋亡及新生血管的生成、导致大肠癌组织的局部免疫抑制。陈玉芳等^[26]研究表明,散发性大肠癌发生发展的可能机制是COX-2基因的去甲基化,促使COX-2蛋白过表达而发生肿瘤或错配修复基因启动子的甲基化导致错配修复酶缺失,继而导致肿瘤的发生。

2.3 IGF2BP3

IGF2BP3是胰岛素样生长因子2信使RNA结合蛋白3,在细胞生长及迁移、RNA转位、固定中扮演重要角色,在诸多研究中被认为是一种参与肿瘤发生发展的原癌基因^[27-28]。Lochhead等^[29]研究证实IGF2BP3与结肠癌等肿瘤的预后密切相关,但其在结肠癌分化中的作用机制尚不明确。常江等^[30]研究发现,结肠癌组织IGF2BP3甲基化水平低于结肠炎组织,且随着分化程度升高,IGF2BP3甲基化水平逐渐升高,提示IGF2BP3 低甲基化是IGFBP3表达升高的主要原因,与结肠组织分化密切相关。IGF2BP3低甲基化可能成为一种新的判断结肠癌分化和预后的重要生物学标志物。

3 可作为标志物检测基因的异常甲基化 3.1 UGT1A1

大肠癌细胞中UGT1A1的甲基化发生在该基因的启动子,这是该基因表达沉默的重要机制。异常甲基化是肿瘤细胞表型中的一种,Xie等^[31]已经从临床角度证明UGT1A1的异常甲基化存在于肿瘤组织中并且在治疗中有针对性的特征。鉴于异常甲基化对调控UGT1A1表达、影响敏感性具有重要作用,推测可以通过调节UGT1A1甲基化程度,来为提高大肠癌化疗疗效建立一个新的领域^[32]。

3.2 SFRP2

SFRP基因有5种,SFRP2作为Wnt信号调控基因,涉及肿瘤的发生和发展,在大多数大肠癌病例中表现出过甲基化^[33]。Tang等^[34]研究中,SFRP2在粪便DNA甲基化[腺瘤患者46%;大肠癌(CRC)患者84%]的灵敏度高于血清DNA(腺瘤患者6%;CRC患者67%)。在Zhang等^[35]研究中,血浆样本检测中,SFRP2呈高甲基化,其中CRC患者达54.39%,大肠腺瘤患者达40.00%。有研究发现^[36-37],正常肠道黏膜每天都会有大量细胞更新脱落进入肠腔,通过粪便排出体外,故通过粪便分析,说明甲基化的SFRP2基因是筛选大肠癌及癌前病变的一个很有前景的敏感标志。

3.3 TFPI2

TFPI2是广谱丝氨酸蛋白酶抑制物,抑制肿瘤细胞胞外基质的降解以及体外集落形成和增殖^[38]。Glöckner等^[39]研究发现,腺瘤甲基化在肿瘤组织达到100%。而在结直肠正常组织中达95%以上。Kenji Hibi等^[40]通过qMSP的方法,检测215例大肠癌患者中39例的DNA血清表现出TFPI2甲基化。该检测率几乎等同于癌胚抗原(CEA)和CA19-9等常规的肿瘤标志物,这表明TFPI2甲基化可能是血清中一种新的肿瘤标记物。

3.4 CNRIPI和SNCA

Bethge等^[41]研究发现正大麻受体相关作用蛋白1(CNRIP1)和α-突触核蛋白(SNCA) 在大肠癌中常发生甲基化,可作为大肠癌的生物标记物。王裴等^[42]应用MSP法检测了大肠癌、腺瘤、增生性息肉患者及健康人群的清晨粪便标本中CNRIP1和SNCA的甲基化,发现大肠癌及腺瘤患者中甲基化率明显高于增生性息肉及健康人群,具有很好的诊断敏感性。

3.5 GATA4

GATA4基因位于人类染色体8p23.1-p22,有7个外显子,是一类含有锌指结构的组织特异性表达的转录因子。Wen等^[43]研究表明GATA4在肿瘤的发生发展中起一定的作用。Bhat等^[44]研究显示GATA4 基因启动子的甲基化导致其表达失活,引起细胞无限制分裂增殖,最终导致大肠癌的发生。在余昆等^[45]的小样本检测中发现,早期大肠癌患者粪便中,GATA4 甲基化检出率为76.7%,显著高于正常人6.7%,且与患者性别、年龄、肿瘤部位等无明显相关性。因此,GATA4可能成为筛查和诊断大肠癌的一个新的指标。

4 讨论

大肠癌是常见的恶性肿瘤,DNA甲基化在其发病机制中起了关键的作用。它不仅发生于大肠癌的早期,更存在于大肠癌发展的整个过程。表观遗传学对异常甲基化的研究,可以更加深入的了解到大肠癌的发病机制,为今后大肠癌的早期诊治、预后判断等提供了更为可靠的依据。在以后的研究中,将致力于将基因检测技术更为精准地应用于临床,通过相应基因指标的甲基化程度来判断大肠癌的分期及预后,继续探索目前研究的药物对降低甲基化在治疗肿瘤方面的疗效和不良反应,寻找更为有效的基因治疗靶点。