2016, Vol. 35文章信息
- 周雪梅, 董玉山, 喇孝瑾, 田春雨, 高秀娟, 贺宝玲, 刘玉洁, 李继安, 陈震, 史佳森, 袁丽丽, 仇继超
- ZHOU Xue-mei, DONG Yu-shan, LA Xiao-jin, TIAN Chun-yu, GAO Xiu-juan, HE Bao-ling, LIU Yu-jie, LI Ji-an, CHEN Zhen, SHI Jia-sen, YUAN Li-li, QIU Ji-chao
- 五子降糖方对T2DM大鼠血糖、C-P及DPP-4活性影响的实验研究
- Experimental study of effect of Wuzi Jiangtang Formula on glucose and C-P of T2DM mice and DPP-4 activity
- 天津中医药大学学报, 2016, 35(6): 390-394
- Journal of fianjin university of traditional chinese medicine, 2016, 35(6): 390-394
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2016.06.08
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文章历史
收稿日期: 2016-07-01
2. 唐山市迁西县卫生局, 迁西 064300;
3. 匈牙利东方国药集团, 匈牙利 布达佩斯 1174
2. Health Bureau of Qianxi County of Tangshan City, Tangshan 064300, China;
3. Oriental Herbs Kft., Budapest 1174, Hungary
二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4) 抑制剂是一种新型2型糖尿病(T2DM)治疗药物, 主要通过延长体内胰高血糖素样肽-1(GLP-1) 降解时间, 促进胰岛素分泌, 发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。前期实验表明五子降糖方可有效改善糖代谢, 但此方是否通过抑制DPP-4活性发挥降糖作用需要进一步验证, 本实验观察了五子降糖方对T2DM大鼠空腹及餐后血糖、血清C肽(C-P)的影响, 建立DPP-4抑制剂体外筛选模型, 对五子降糖方及其组成药物进行筛选, 探讨其发挥降糖作用及改善胰岛β细胞功能的新机制。
1 材料 1.1 实验动物SPF级GK雄性大鼠54只, 体质量(300±20) g, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司, 许可证号 SCXK(沪)2012-0002, 动物合格证编号2007000577867。饲养于华北理工大学10000级屏障环境动物实验室[SYXK(冀)2010-0038], 室温20℃, 相对湿度45%, 光暗周期(12 h/12 h)。
1.2 药物与试剂五子降糖方由菟丝子、女贞子、紫苏子、莱菔子、车前子组成, 购自北京同仁堂唐山连锁药店有限公司, 磷酸西格列汀片(杭州默沙东制药有限公司, 产品批号k005113) , DPP-4(Sigma公司, 批号SLBK3698V), 甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(Sigma公司, 批号SLBJ8491V), C肽测定试剂盒(北京凯诺春天生物科技有限公司, 批号20150401A), 二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司, 批号1407117) 。
1.3 主要仪器BS224S精密电子天平(德国Sartorius公司), GZX-9240数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂), M200PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)。
2 方法 2.1 药物提取方法五子降糖方按照其组成药物菟丝子:女贞子:紫苏子:莱菔子:车前子(3:3:2:2:2) 比例混合, 8倍量加水煎煮2 h, 煎煮2次, 2次药液混合, 浓缩收膏, 浓缩收膏率31%。
2.2 GK大鼠造模、分组、给药与指标检测54只GK大鼠适应性喂养1周, 给予高脂饲料喂养, 连续4周, 测定空腹血糖(FBG)和餐后2 h血糖(2 h PG), 随机血糖>11.1 mmol/L, 2 h PG>16.7 mmol/L[1]为成模标准, 共成模50只, 将成模GK大鼠随机分为模型组、二甲双胍组(简称二甲组)、五子降糖方高、中、低剂量组(简称五子高中低组), 每组10只。选取10只Wistar大鼠作为正常组, 给予普通饲料喂养。各组灌胃相应药物, 模型组与正常组灌胃等体积纯净水, 给药量按照大鼠与人换算公式计算(每日7.5 mg/kg)[2-3], 二甲组灌胃0.1 g/kg盐酸二甲双胍混悬液, 五子降糖方分别灌胃3.5、7.0、14.0 g/kg(折合生药量), 共给药8周, 采用葡萄糖氧化酶法测定给药前、给药后大鼠FBG及2 h PG, 给药8周后取大鼠腹主动脉血清, 采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测C-P水平。
2.3 DPP-4抑制剂体外筛选体系的建立及对五子降糖方及组成药物进行DPP-4抑制剂的筛选实验分4组[4-7], 每组设3个复孔, 分别为空白组、阴性对照组、阳性对照组、阳性空白组, 具体见表 3。按照药物、酶、缓冲液、底物顺序加入96孔板, 37℃孵育30 min, 于405 nm处测定吸光度(A), 经反复摸索确定反应体积为100 μL, 对酶浓度、底物浓度、反应缓冲液pH值、反应时间进行优化。设1、2、3、4、5 mg/L浓度梯度的磷酸西格列汀片[8]对上述反应体系进行验证。DPP-4抑制剂体外筛选模型建立后, 保留原分组, 加干预药物组、干预药物空白组对五子降糖方及其组方单味中药进行筛选, 干预药物浓度设为200 mg/L, 按照上述反应体系对干预药物进行初步筛选, 剔除DPP-4抑制作用不明显的药物, 对DPP-4抑制率>10%的药物进行复筛, 复筛药物设25、50、100、200、400 mg/L 5个浓度梯度, 测定A值, 计算抑制率, 比较IC50差异。
2.4 统计学处理实验数据应用SPSS 20.0软件及Excel 2007进行分析, 实验结果均以均值±标准差(x±s) 表示。多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较方差齐采用LSD法, 方差不齐采用Dunnett's T3法, P＜0.05为差异有统计学意义。
抑制率计算公式:[(阴性对照组-阴性空白组)-(阳性对照组-阳性空白组)]/[(阴性对照组-阴性空白组)]。
3 结果 3.1 五子降糖方对T2DM大鼠FBG和2h PG影响测定大鼠FBG, 见表 1。给药前各组与正常组比较均有显著性差异(P＜0.01) , 但各组之间不存在差异性(P>0.05) 。给药4周后测定FBG, 与正常组比较, 模型组、二甲组、五子低组有显著性差异(P＜0.01) , FBG水平都高于正常组, 五子中组、五子高组没有差异(P>0.05) 。与二甲组比较, 五子低组没有显著性差异(P>0.05) , 效果相当, 五子中组、五子高组均有显著性差异(P＜0.01) , 效果优于二甲组, 给药8周后, FBG五子各组均与正常组无显著性差异(P＜0.05) , 效果优于二甲组。测定大鼠2 h PG, 见表 2。给药前模型组与五子各组之间没有差异性(P>0.05) , 给药4周后与模型组比较二甲组、五子低组存在差异(P＜0.05) , 五子中组、五子高组差异显著(P＜0.01) , 二甲组与五子各组比较(P>0.05) , 效果相当。给药8周后各组与模型组比较均有显著性差异(P＜0.01) , 与二甲组比较五子低组存在差异(P＜0.05) , 五子中组、五子高组均存在显著性差异(P＜0.01) , 五子各组效果均优于二甲组。
| 组别 | n | 给药前 | 给药4周 | 给药 8 周 |
| 正常组 | 10 | 4.9±0.4 | 5.0±0.4 | 4.9±0.6 |
| 模型组 | 10 | 9.0±0.4** | 11.7±1.6** | 11.9±1.8** |
| 二甲组 | 10 | 9.1±0.7** | 8.3±0.7**# | 7.7±0.8**## |
| 五子低组 | 10 | 9.2±1.0** | 8.5±1.3**# | 6.2±1.5##△ |
| 五子中组 | 10 | 9.0±0.9** | 6.2±1.0##△ | 5.8±0.8##△△ |
| 五子高组 | 10 | 9.1±1.0** | 5.9±1.1##△△ | 5.1±0.8##△△ |
| 注:与正常组比较, **P＜0.01;与模型组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01;与二甲组比较, △P＜0.05, △△P＜0.01。 | ||||
| mmol/L | ||||
| 组别 | n | 给药前 | 给药 4 周 | 给药 8 周 |
| 模型组 | 10 | 16.8±2.5 | 18.1±1.6 | 19.2±1.0 |
| 二甲组 | 10 | 17.1±1.9 | 16.4±1.2* | 16.4±1.2** |
| 五子低组 | 10 | 17.4±1.5 | 16.4±1.0* | 15.0±1.5**# |
| 五子中组 | 10 | 17.8±2.7 | 15.7±0.8** | 13.9±0.6**## |
| 五子高组 | 10 | 16.7±2.6 | 14.5±1.8**# | 14.0±1.3**## |
| 注:与模型组比较, *P＜0.05, **P＜0.01;与二甲组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01。 | ||||
正常组与模型组二甲组、五子低组比较均存在显著性差异(P＜0.01) , 与五子中组、五子高组比较不存在差异(P＜0.05) 。与模型组比较, 二甲组、五子低组, 存在差异(P＜0.05) , 五子中组、五子高组, 存在显著性差异(P＜0.01) 。二甲组与五子低组比较不存在差异性(P＜0.05) , 效果相当。与五子中组比较(P＜0.01) , 与五子高组比较(P＜0.05) , 效果优于二甲组。见表 3。
| 组别 | n | C肽 |
| 正常组 | 10 | 242±8.8 |
| 模型组 | 10 | 202± 7.3** |
| 二甲组 | 10 | 211±10.9**# |
| 五子低组 | 10 | 212±7.7**# |
| 五子中组 | 10 | 239±4.8##△△ |
| 五子高组 | 10 | 235±9.6**## |
| 注:与正常组比较, **P＜0.01;与模型组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01;与二甲组比较, △P＜0.05, △△P＜0.01。 | ||
见表 4。
| μL | ||||
| 组别 | 药物 | 酶 | 缓冲液 | 底物 |
| 空白组 | 90 | 10 | ||
| 阴性对照组 | 10 | 80 | 10 | |
| 阳性对照组 | 10 | 10 | 70 | 10 |
| 阳性空白组 | 10 | 80 | 10 | |
| 注:反应体系各条件确定:酶浓度4 U/L, 底物浓度0.05 mmol/L, 最佳缓冲液pH 8.2, 温度37℃, 时间30 min。 | ||||
初筛结果女贞子、车前子、紫苏子抑制作用不明显, 对莱菔子、菟丝子、五子降糖方进行复筛, 复筛结果见表 5。莱菔子IC50为(382.56±7.75) mg/L, 菟丝子IC50为(843.39±135.23) mg/L, 五子降糖方IC50为(6 667.75±2 119.76) mg/L, 磷酸西格列汀片IC50为(0.11±0.00) mg/L, 对DPP-4抑制作用强弱比较磷酸西格列汀片>莱菔子>菟丝子>五子降糖方总方。
| 中药名称 | n | 质量浓度(mg/L) | 抑制率(%) | IC50值(mg/L) |
| 莱菔子 | 25.0 | 0.03±0.01 | 382.56± 7.75 | |
| 50.0 | 0.20±0.01 | |||
| 100.0 | 0.27±0.01 | |||
| 200.0 | 0.40±0.00 | |||
| 400.0 | 0.46±0.01 | |||
| 菟丝子 | 4 | 25.0 | 0.11±0.00 | 843.39± 135.23 |
| 50.0 | 0.12±0.01 | |||
| 100.0 | 0.18±0.01 | |||
| 200.0 | 0.21±0.02 | |||
| 400.0 | 040±0.01 | |||
| 五子降糖方 | 4 | 25.0 | 0.09±0.01 | 6 667.75±2 119.76 |
| 50.0 | 0.15±0.01 | |||
| 100.0 | 0.17±0.01 | |||
| 200.0 | 0.20±0.01 | |||
| 400.0 | 0.26±0.01 | |||
| 磷酸西格列汀片 | 4 | 0.1 | 0.48±0.01 | 0.11± 0.00 |
| 0.2 | 0.64±0.01 | |||
| 0.3 | 0.75±0.01 | |||
| 0.4 | 0.78±0.07 | |||
| 0.5 | 0.82±0.00 |
2型糖尿病属中医消渴范畴, 中医学认为本病是一种虚实夹杂的复杂证候, 《灵枢五脏》云:"肾脆则善病消瘅, 易伤。"《外台秘要·消渴消中门》强调:"消渴者, 原其发动, 此则肾虚所致, 每发即小便至甜。"进一步说明肾亏是其患病的关键。《素问·通评虚实论》言:"消瘅……肥贵人, 则膏梁之疾也。"《素问奇病论篇》云:"脾瘅, 此肥美之所发也, 此人必数食甘美而多肥也。"则强调了过食肥甘厚味可致消瘅;由此可见先天不足, 气化不及与后天饮食肥甘太过是消渴病发病的主要因素。气化功能下降为发病之根, 脂浊痰湿堆积为发病之因, 五子降糖方中菟丝子温补肾阳的同时平补肾阴, 女贞子性凉, 归肝肾经, 具有滋补肝肾之阴的功效, 两者合用, 使肾之阴阳得补, 肾气得充, 进而蒸腾、气化推动和调节胃之"游溢精气"、脾之"散精"、肺之"通调水道", 使津液输布代谢正常, 则痰浊无以内生。紫苏子降气消痰, 莱菔子消食导滞、下气除痰, 车前子泻而通之, 泻有形之邪浊, 涩中兼通, 补而不滞。五药配伍使肾虚得补、气机得畅、痰浊得化。现代药理表明菟丝子及其单体成分可能通过抑制α-淀粉酶的活性、抗氧化应激、增强免疫功能等发挥降糖作用[9-10], 女贞子提取物及其单体成分降糖作用可能与抑制α-葡萄糖苷酶、改善胰岛素抵抗相关[11], 莱菔子可以调节血脂, 提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平[12]。前期实验研究表明五子降糖方可以降低2型糖尿病大鼠FBG和2 h PG血糖, 增加肝脏糖原含量, 其机制可能与提高骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4) 表达水平、抗氧化、抗炎及改善胰岛β细胞功能, 提高肝脏蛋白激酶(AKT)及糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)丝氨酸位点磷酸化水平有关[13-15]。由此说明该方是通过多途径、多环节、多靶点发挥整体降糖作用的, 除上述已经阐释的作用机制外, 是否还有其他改善糖代谢机制尚需进一步探讨。
GK大鼠是一种自发性非肥胖型糖尿病模型大鼠, 在远交系Wistar大鼠中筛选高血糖个体而成。糖尿病发作后, 很快出现高血糖、胰岛素分泌减弱等症状, 后期容易出现视网膜、微血管、神经、肾脏病变等, 其发病机制与T2DM机制及其类似[16-17]。本实验选取GK模型大鼠, 结果表明, 正常组GK大鼠毛色较白且有光泽, 精神状态活跃, 粪便及尿量正常, 模型组毛色明显发黄无光泽, 精神状态萎靡, 尿量增多且部分大鼠出现便溏, 二甲组及五子各组状况较模型组均有所改善。给药4周后测定FBG, 五子中组、五子高组可以将GK大鼠FBG降低到正常水平, 五子低组与二甲组效果相当, 五子中组、五子高组降糖效果优于二甲组。给药8周测定FBG水平, 五子各组均可以达到正常水平, 效果优于二甲组。测定2 h PG, 给药4周后二甲组与五子各组效果无差异性, 给药8周五子各组效果均较二甲组明显。GK大鼠模型组C-P水平减少, 提示胰岛β功能损伤, 五子降糖方可以显著增高C-P, 降低GK大鼠FBG及2hPG水平, 并且可以改善胰岛β细胞功能。
近年来以DPP-4抑制为靶点的中药降糖机制研究报道越来越多, DPP-4抑制是一种新的T2DM治疗途径, 其主要通过延长体内GLP-1降解时间发挥降糖作用。GLP-1是一种肠促胰岛素, 体内外研究显示GLP-1具有较好的抗糖尿病效应, 它具有血糖依赖性的肠促胰岛素作用, 可以避免餐后高血糖的风险, 同时又阻止胰腺β细胞退化, 刺激β细胞的增殖和分化, 促进胰岛素的释放[18-21], 可改善糖尿患者的血糖代谢。但是由于GLP-1在体内很快被以DPP-4为主的酶降解, 因而抑制DPP-4能一定程度延长GLP-1在体内的半衰期, 从而有效地发挥GLP-1降血糖效应。近年来, 已有学者开展了以DPP-4抑制为靶点的中药研究, 并且发现葫芦巴、鹰嘴豆、石榴皮、水蛭、茯神、密蒙花等具有一定的DPP-4抑制作用[4-6]。本实验证明五子降糖方可以有效降低GK大鼠FBG和2 h PG血糖, 改善胰岛β细胞功能, 为了进一步探讨该方的作用机制, 又对五子降糖方及其组成药物进行了DPP-4抑制作用的筛选, 实验结果表明五子降糖方具有DPP-4抑制作用, 莱菔子、菟丝子可能是其发挥DPP-4抑制作用的主要药物, 进而说明五子降糖方的DPP-4抑制作用是其降低血糖, 改善胰岛β细胞功能的又一作用机制, 因该方均为天然植物中药, 安全性好, 不良反应小, 适合长期服用, 对指导临床和药物开发具有重要意义。
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