肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticola Y. C. Ma)或管花肉苁蓉[Cistanche tubulosa(Schrenk)Wight]干燥带鳞叶的肉质茎,别名大芸,是传统的补肾阳中药,最早记载于《神农本草经》,列为上品,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。主治男子阳痿、女子不孕、血枯便秘等症,有"沙漠人参"之美誉^[1]。肉苁蓉主要成分有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷、木脂素及甾醇等^[2-4],其中苯乙醇苷类是评价肉苁蓉质量、鉴别肉苁蓉真伪的重要指标。苯乙醇苷类是肉苁蓉抗衰老、抗疲劳、补肾助阳、抗老年性痴呆等药理作用的主要活性成分^[5-7],其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是肉苁蓉苯乙醇苷类的含量较高的两种有效成分,故本文通过测量松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量^[8],初步考察市场销售的肉苁蓉的苯乙醇苷含量。由于肉苁蓉资源稀少,价钱昂贵,导致市场上肉苁蓉质量参差不齐,甚至出现一些伪品假品,本实验对不同市场购买的肉苁蓉饮片指纹图谱鉴定^[9],进而评价市售肉苁蓉饮片初步评价,以期更好地指导临床应用。

1 仪器与试药 1.1 仪器

LC-2010A HT高效液相色谱仪及工作站(岛津公司),KQ-300B超声清洗器(昆明市超声仪器有限公司),FA210型电子分析天平(上海舜宇恒科学仪器有限公司),FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇(色谱纯,天津市康克德科技有限公司),甲酸(色谱纯,天津市元立化工有限公司),蒸馏水(广州市屈臣氏食品饮料有限公司),肉苁蓉松标准药材(批号121101-200402) ,松果菊苷(批号AB739E),毛蕊花糖苷(批号AB732A)购自天津一方科技有限公司。肉苁蓉饮片购自不同省市,见表 1。

2 指纹图谱方法与结果 2.1 色谱条件

Kromasil C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈为流动相A,0.2%磷酸溶液为流动相B,梯度洗脱程序为(A)0~10 min,9%~15%A;10~45 min,15%~30%A;45~50 min,30%~9%A;柱温30℃,流速1.0 mL/min,检测波长为330 nm,进样量10 μL。

2.2 供试品制备

取干燥的肉苁蓉粉末(过60目筛)约0.5 g,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,加甲醇25 mL,密塞,称质量,浸泡12 h,超声(功率250 W,频率40 kHz)提取30 min,放冷,再称质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,静置,上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过,续滤液置棕色瓶中,即得。

2.3 测定方法

各供试品溶液进样10 μL,在上述色谱条件下进行分离测定,记录色谱图。色谱图为参照图谱,计算不同省市购买的肉苁蓉饮片相似度。

2.4 稳定性实验

取同一样品供试品,分别于0、2、8、12、24 h检测,其主要共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3%,表明样品24 h内稳定。

2.5 精密度实验

取同一样品供试品,连续进样5次,其主要共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3%,表明其精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一样品5份,分别处理测定,其主要共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3%,表明其重复性良好。

2.7 指纹图建立与分析

采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版),对10个省市购买肉苁蓉饮片的HPLC谱图进行综合评价,见图 1,以标准药材肉苁蓉为参照图谱,其相似度评价结果见表 2。

2.8 结果

从指纹图谱和相似度结果可得,福建、江苏和山东其相似度较低,鉴定不是肉苁蓉饮片,可能为伪品蛇菰和多蕊蛇菰的全草或者其替代品盐生肉苁蓉、沙苁蓉和草苁蓉等饮片。

3 含量测定方法与结果 3.1 色谱条件

Kromasil C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇为流动相A,0.1%甲酸溶液为流动相B,梯度洗脱程序为(A)0~10 min,27%A;10~13 min,27%~32%A;13~28 min,32%A;28~31 min,32%~35%A;31~47 min,35%A;47~49 min,35%~60%A;49~55 min,60%A;柱温30℃,流速0.8 mL/min,检测波长为330 nm,进样量10 μL,色谱图见图 2。

3.2 标准溶液制备

精密称定松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品5.05、5.24 mg,分别置于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容至刻度,制成含有松果菊苷、毛蕊花糖苷分别为1.01、1.12 g/L的对照品储备液。

3.3 供试品溶液的制备

将肉苁蓉样品粉碎,精密称取粉末(过四号筛)1 g,置100 mL棕色量瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,密塞,称定质量,浸泡30 min,超声处理40 min,放冷,再称定质量,补足失重,摇匀,静置,取上清液过0.45 μm微孔滤膜,续滤液即为供试品溶液。

3.4 线性关系考察

分别精密量取松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品储备液适量置于5 mL容量瓶混匀,加入50%甲醇溶液稀释得到一系列浓度标准对照品溶液,松果菊苷标准对照品浓度为10.1、20.2、40.4、101、202.0、505.0 mg/L,毛蕊花糖苷标准对照品浓度为10.4、20.9、41.9、104.8、209.6、524.0 mg/L,吸取10 μL注入高效液相色谱仪,测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线,松果菊苷回归方程为$\hat{Y}$=14 944X-56 953,(r=0.998 5) 线性范围为0.101~5.050 μg毛蕊花糖苷回归方程为$\hat{Y}$=18 269X-84 581,(r=0.998 6) 线性范围为0.104~5.240 μg。

3.5 精密度实验

取浓度约为0.1 g/L的混合对照品,连续进样6次,松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品峰面积RSD分别是0.18%和0.26%,表明精密度良好。

3.6 稳定性实验

精密称取肉苁蓉粉末1 g,按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液,分别于0、1、2、6、12、24 h进样,供试品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.60%和1.10%,说明供试品溶液在24 h内稳定。

3.7 重复性实验

取同一市场肉苁蓉粉末6份,精密称定,每份取样量约为1 g,按样品制备方法制备并测定每份的含量。供试品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的RSD分别为1.20%和0.79%,说明样品分析的结果稳定,该方法的重复性良好。

3.8 加样回收率实验

精密称取肉苁蓉粉末约20 mg,按照表加入松果菊苷、毛蕊花糖苷的标准溶液(相当于肉苁蓉药材中松果菊苷、毛蕊花糖苷的80%、100%、120%的含量),按2.3项下操作制备供试品溶液,在2.1项的色谱条件下分析,计算回收率。见表 3。

3.9 样品测定

精密称取肉苁蓉粉末1 g,平行3份,按2.3项下操作制备供试品溶液,在2.1项的色谱条件下分析,记录峰面积,计算松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量。

3.10 结果

2010版《中国药典》按干燥品计算肉苁蓉含松果菊苷(C35H46O20) 和毛蕊花糖苷(C35H46O20) 的总量不得少于0.30%,本实验结果,中山东购买的肉苁蓉饮片苯乙醇苷类含量低于《中国药典》要求。见表 4。

4 讨论

本实验通过中药指纹图谱鉴别不同省市购买的肉苁蓉饮片的真伪,同时测定苯乙醇苷类有效成分含量,初步评价市售肉苁蓉饮片质量。根据本实验的结果可知市售的肉苁蓉饮片真伪存在问题,市场销售的肉苁蓉饮片苯乙醇苷类的含量差异性,折射出肉苁蓉的质量差异很大,其原因可能为药源不同、采收产地不同、季节不同等,这对临床用药影响很大。

实验过程中,在不同市场采购的肉苁蓉品相也不同,不同市场销售的肉苁蓉的炮制工艺不同导致其品相差异,颜色差异性很大,南方沿海地区的多为深棕色、黏性较大,北方地区多为黄色、黏性小、纤维性较强。炮制工艺的不同也可能导致苯乙醇苷类含量的差异。

松果菊苷和毛蕊花糖苷这两种苯乙醇苷类都对光较敏感,其稳定性较差,其对照品需要避光、冷冻、干燥储藏,测量时尽量在短时间内测完样品和标准品,以免发生异构化等。实验过程中,应采用50%的甲醇溶液(即提取液),若纯甲醇配制的标准品测量过程中松果菊苷容易出现峰的分裂或出现肩缝而采用50%的甲醇溶液后松果菊苷的分裂峰或者肩缝没有出现。从分子结构上看,松果菊苷含有较长的共轭体系和羟基,不稳定,在纯甲醇中可能发生异构化,可能是造成分裂峰和肩缝的原因;50%的甲醇中含有水有大量的羟基,可能形成分子间氢键,使松果菊苷稳定加强,峰型变好。实验过程中,温度对松果菊苷和毛蕊花糖苷的保留时间影响较大,保持较恒定的温度较重要,也易于样品中苯乙醇苷类的鉴别定位。

5 结论

从实验的结果中分析不同市场销售的肉苁蓉饮片,福建、江苏和山东购买的肉苁蓉饮片为伪品,其他省市购买的肉苁蓉饮片为正品且其苯乙醇苷类符合药典要求,但含量差异性较大。