二磷酸腺苷(ADP) 受体P2Y12是Gi偶联型的G蛋白偶联受体(GPCR)，是血小板聚集的关键受体，也是抗血小板药物研究的主要靶点。同时血小板膜受体P2Y12与糖尿病患者的抗血小板药物抵抗、高血压，冠心病、缺血性卒中等一系列病症均有一定相关性^[1-2]。ADP与P2Y12受体结合后，P2Y12受体通过与Gi蛋白偶联，使血小板颗粒分泌血栓素A2 (TXA2), 激活纤维蛋白原受体，从而实现血小板的聚集。活化后的P2Y12受体，既可以引起血小板自身的活化，也可以通过与Gi蛋白偶联激活其信号的传导通路, 抑制血小板腺苷酸环化酶的活化, 降低环磷酸腺苷(cAMP) 在细胞内水平，引发血小板的聚集^[3]。目前，针对P2Y12受体的拮抗药物主要有普拉格雷、坎格雷洛、替格雷洛、依诺格雷等，但都伴随起效慢，并发出血症，需药物联用等不足。针对P2Y12受体拮抗药物的开发，仍有很大的空间^[4]。而无标记高通量筛选，作为一种新型高通量药物筛选模式，是一种利用生物传感器，针对细胞的动态物质重分配原理(DMR) 而开发的检测，对于其应用于GPCR受体药物开发，具有影响低，可提供广泛的、无创的细胞信号动力学高通量扫描，不局限于某一特定的细胞信号通路反应等优势^[5-6]。本项研究旨在通过获得pCMV-hP2Y12-C-His稳定转染HEK293细胞系，以建立ADP受体P2Y12为靶标的无标记细胞表型筛选方法。

1 材料与方法 1.1 材料

HEK293细胞系(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，pCMV-C-His质粒(碧云天公司，D2650)，LB培养基(生物生工公司，SD7002)，大提质粒试剂盒(Transgen，H10105)，PE (I Polysciences, 23966-2)，G418 (Merck Millipore，D00117999)，Tks GflexTM DNA Polymerase (TaKaRa，R060A)，胶回收试剂盒(Axygen ap-gx-250)，限制性内切酶(NEB，Hind Ⅲ R0104s、BamHI R0136S，buffer2.1 B7202s)，T4连接酶(NEB，M0202T)，HEPES缓冲液(invitrogen，15630-080)，平衡盐(HBSS)，缓冲液(Invitrogen，14025-126)，EnSpire-LFC，384孔板(PerkinElmer，5740-14212)，ADP (SIGMA，F3879)，替卡格雷(selleck，S4079)，Anti-His tag antibody (碧云天，AH367)，β-Actin antibody (中杉金桥，TA-09)，DMEM培养基(Gibco，12800-017)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，qRT-PCR试剂盒和Fast start Universal SYBR Green Master (Roche)，Trizol、RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)。

1.2 pCMV-P2Y12-C-His表达载体构建

P2Y12模板DNA以Tks GflexTM DNA Polymerase扩增，5’端引入酶切位点Hind Ⅲ，3’端引入酶切位点BamHI。引物信息如下：pCMV-hP2Y12-C-His-sense，CGCggatccATGCAAGCCGTCGACAATCT，pCMV-hP2Y12-C-His-anti，AGCaagctt CATTGGAGTCTCTT CATTTG，P2Y12 PCR产物进行凝胶回收产物、pCMV-C-His载体进行BamHI Hind Ⅲ双酶切(37 ℃ 1 h)，酶切产物进行凝胶回收，凝胶回收产物T4连接酶连接(16 ℃，过夜) ^[7-8]。

1.3 建立

pCMV-hP2Y12-C-His稳定转染的细胞系参考文献[9]标准。

1.3.1 pCMV-hP2Y12-C-His的转染实验

HEK293细胞以每孔10⁵个接种到6孔板中，细胞融合度达80%后，按照PEI:DNA=3 μL:1 μg的比例将PEI试剂、DNA溶液分别与250 μL不含血清DMEM的基础培养基涡旋混匀，静置20 min后，两种混合液加到一起，再次涡旋混匀，静置20 min。弃去6孔板中细胞培养液，磷酸盐缓冲溶液(PBS) 小心清洗2次后，将转染液加到细胞中，DMEM基础培养基补齐至2.5 mL。6 h后弃去转染液，换成DMEM完全培养基在37 ℃、5%二氧化碳(CO₂) 饱和湿度培养24 h后，换为含有500 mg/L的DMEM完全培养基培养，每3 d左右换液1次，直至6孔板内的细胞生长起来，约15~20 d左右，然后进行扩大培养。

1.3.2 转染细胞系pCMV-hP2Y12-C-His的qRT-q PCR鉴定

以Trizol提取细胞总RNA，分光光度法测定RNA浓度，A 260/280比值在1.8~2.0间，琼脂糖凝胶电泳显示28S亮度在18S条带的两倍以上，条带清晰无拖尾现象。按照逆转录试剂盒说明书操作获取cDNA，然后进行qRT-PCR检测，反应体系：cDNA模板1 μL，引物sense，anti各1.25 μL (pCMV-hP2Y12-C-His-sense CGCggatccATGC-AA GCCGTCGACAATCT，pCMV-hP2Y12-C-His-anti AGCaagcttCATTGGAGTCTCTTCATTTG) Supermix 12.5 μL，RNase-free water 9.0 μL。反应条件：95 ℃ 3 min预变性，95 ℃ 30 s变性，60 ℃ 40 s退火，72 ℃ 40 s延伸，共42个循环。溶解曲线条件设定：95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃。采用△△Ct法分析qRT-PCR实验结果。

1.3.3 转染细胞系P2Y12-His Western Blot鉴定

pCMV-hP2Y12-C-His稳转细胞系提取总蛋白, BCA法测定蛋白浓度，上样量40 μg。分离胶选用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶浓度为5%。完成蛋白分离后，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭过夜，孵育一抗Anti-His-tag antibody (1:1 000倍稀释)4 ℃过夜，洗去一抗后孵育二抗羊抗鼠IgGHRP (1:5 000)，室温孵育1 h，洗去二抗，试剂盒显色，暗室显影。使用一抗、二抗去除液洗去His-tag的一抗和二抗，5%脱脂奶粉重新封闭，同样条件孵育Anti-βactin antibody (1:4 000) 及二抗羊抗鼠IgG-HRP (1:5 000)，再次显影。

1.4 稳转细胞系Lable-free功能检验

参考文献[10-12]标准制定。

1.4.1 P2Y12受体激动剂ADP对该体系作用

第1天：试剂准备检测缓冲液[1LHBSS+20 mL 1 mol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES) 储备液]，pCMVhP2Y12-C-His稳转细胞以每孔104个种板培养12 h。第2天：将培养液移除，换至检测缓冲液，放置机器中，温度平衡90 min，同时开始准备化合物待用，温度平衡好后进行基线读取30 min。快速加入激动剂ADP，终浓度分别是200、20、2、0.2、0.02、0(对照组)μmol/L，轻轻混匀1次，立即放入机器中，进行最终值读取1 h。

1.4.2 P2Y12受体抑制剂替卡格雷对该体系作用

第1天：试剂准备检测缓冲液(1 L HBSS+20 mL 1 mol/L HEPES储备液)，pCmv-hP2Y12-C-His稳转细胞以每孔10⁴个种板，培养12 h。第2天：将培养液移除，换至检测缓冲液，放置机器中, 温度平衡90 min，同时开始准备化合物待用，温度平衡好后进行基线读取30 min。加入抑制剂替卡格雷，终浓度分别是2、0.2、0.02、0.002、0.000 2、0 (对照组)μmol/L，轻轻混匀1次，孵育30 min后，加入终浓度为20 μmol/L的ADP，轻轻混匀1次，立即放入机器中，进行最终值读取，时间为1 h。

1.5 数据分析

采用Graphpad Prism5.0作图，SPSS 18.0软件进行统计分析。采用Image J软件对X线片进行数据处理：首先将压好的X线片经扫描形成电子版后用Image J软件分析条带光密度值，计算每个目的蛋白条带光密度值与内参光密度值的比值，并以对照组的值均一化后表示，采用T-test方法分析, 结果用均数±标准差(x±s) 表示。P2Y12受体激动剂ADP对该体系作用实验结果采用单因素方差分析，实验结果采用均数±标准差(x±s) 表示。

2 实验结果 2.1 pCMV-hP2Y12-C-His稳定转染细胞系qRTPCR及Western Blot验证 2.1.1 qRT-PCR结果

见图 1、表 1。实验组、对照组各设2个复孔，由图 1可见，稳转P2Y12细胞组先于HEK293细胞组起峰。

量化分析结果，P2Y12-His在P2Y12-HEK293细胞系表达比未转染HEK293细胞mRNA量表达量提高了86.82倍。

2.1.2 Western Blot结果

见图 2。上样量均为40 μg，由胶图结果可见，P2Y12-His稳转细胞有清晰蛋白条带，而HEK293细胞则没有。量化分析结果表明，与对照组相比，P2Y12-HEK293细胞蛋白表达量显著性增加，P＜0.01 (n=3)。

2.2 P2Y12受体激动剂ADP对该体系作用

见图 3、图 4、图 5。Enspire多功能读板机检测激动剂ADP对于pCMV-hP2Y12-C-His稳定转染细胞作用影响，ADP终浓度分别是200、20、2、0.2、0.02、0(对照组)μmol/L，当ADP浓度为2 μmol/L至200 μmol/L时，与对照组有显著性差异，P < 0.01(n=3)，求得EC₅₀为3.38 μmol/L，与文献报道一致^{[3, 13]}。

Enspire多功能读板机检测抑制剂替卡格雷对于pCMV-hP2Y12-C-His稳定转染细胞系作用影响, 替卡格雷终浓度为2、0.2、0.02、0.002、0.000 2、0 (对照组)μmol/L，ADP浓度为20 μmol/L。当替卡格雷浓度在0.002 μmol/L以上时，与对照组相比有显著性差异，P < 0.01(n=4)，P＜0.05(n=4)，求得IC₅₀为0.002 1 μmol/L，与文献报道一致^{[3, 13]}。

Lable-free Enspire实验表明P2Y12受体激动剂ADP，抑制剂替卡格雷，均有显著的激动及抑制作用，具有明确的量效关系，由于HEK293细胞本身并无其他ADP受体表达，因此可以认为ADP，替卡格雷的信号反应均是针对受体P2Y12^[14]。由此，本实验可以认为是成功建立了ADP受体P2Y12的Lable-free Enspire多功能读板机的无标记高通量筛选方法。

Enspire多功能读板机检测30种中药单体及组分针对受体P2Y12的作用效果，中药单体及阳性药Ticagrelor终浓度均为1 μmol/L，组分终浓度为20 mg/L，激动剂ADP终浓度为20 μmol/L，筛选结果为样品3、5、7、16、17、25、27抑制P2Y12活性显著，为进一步筛选、机制研究等提供基础数据支持。

3 讨论

目前用于基于配体受体结合的GPCR高通量筛选实验方法主要有放射性同位素受体配体结合、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET) 等方法，由于并不是基于功能的分析，尽管能够判断受体与配体的结合，但得到的信息很有限，而且操作复杂，对细胞干扰因素较多^[15-16]。而Lable-free针对GPCR的检测，是基于受体偶联Gi、Gq、Gs3种不同的G蛋白，会呈现3种不同的动力学扫描图谱，由于这3种G蛋白分别对应着不同的下游信号反应：Gi与GS作用类似，通过GTP-GDP交换来调节信号传导，受体与GS偶联后，cAMP减少，与Gi偶联后，cAMP释放增加，Gq通过IP3-Ca²⁺信号途径，调节Ca2+释放。所以，Lable-free Enspire检测系统具有一定的预测下游信号通路的功能，是更优于目前已有的方法的检测手段^[17]。本研究意在建立一种方便快捷的GPCR高通量筛选方案，实验具有以下需注意的事项：1) Lable-free Enspire系统对于温度较为敏感，应注意实验环境的温度控制，25 ℃最为适宜。2) 考虑到实验的稳定性及平行性，应保证所用的稳转细胞代数，平行实验之间要使用相临近代数的细胞。3) 实验前，细胞要提前放置仪器周围平衡1~2 h，使细胞充分适应缓冲液环境及温度。