2017, Vol. 36文章信息
- 梁照, 鲁秋丹, 金哲
- LIANG Zhao, LU Qiu-dan, JIN Zhe
- 丹枝饮对盆腔炎性疾病后遗症小鼠体内炎性因子的影响
- Effect of Danzhi decoction on serum levels of inflammatory factors in murine model with sequelae of pelvic inflammatory disease
- 天津中医药大学学报, 2017, 36(1): 33-37
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2017, 36(1): 33-37
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2017.01.09
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文章历史
收稿日期: 2016-09-30
2. 北京中医药大学东方医院, 北京 100078。
盆腔炎性疾病后遗症(SPID) 是妇科最常见的感染性疾病，是盆腔炎性疾病(PID) 未得到及时正确的治疗而发生的女性生殖道周围的组织的破坏、粘连、增生及瘢痕形成等一系列后遗症[1]，盆腔炎性疾病多发生在性活跃时期有月经的妇女，若未能及时彻底的治疗，可能会发生慢性盆腔痛、不孕、异位妊娠及盆腔炎性疾病反复发作等后遗症[2]，即盆腔炎性疾病后遗症(SPID)。盆腔炎性疾病严重影响育龄期妇女的生殖健康，对女性健康、心理及生活质量产生不良影响，也给家庭和社会带来沉重的负担。现代医学对SPID的治疗以服用抗生素为主，但由于近年来抗生素的滥用，病原菌对药物产生一定的耐药性，使其不能达到较好的治疗目的，因此中医药在治疗盆腔炎性疾病后遗症具有明显的优势[3-4]。丹枝饮是北京中医药大学东方医院金哲教授的经验方，通过中药化瘀通络之法改善盆腔血瘀微环境，调节机体免疫力，达到抗菌消炎的目的，在临床上取得了确切的疗效[5-7]。本研究以盆腔炎性疾病后遗症小鼠为研究对象，观察丹枝饮对SPID小鼠血清炎性因子白介素-17A (IL-17A)、白介素-17F (IL-1F)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白-2 (MIP-2) 表达水平的影响，探讨盆腔炎性疾病后遗症的发病机制及丹枝饮治疗SPID的药理作用机制，现报道如下。
1 实验材料 1.1 实验动物SPF级BALB/c小鼠48只，雌性，7~8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK (京)2012-0001。实验动物饲养于生物安全Ⅱ级实验室，温度(25±1)℃，相对湿度40%~70%。
1.2 实验药物丹枝饮包括：丹参10 g，桑枝10 g，川芎6 g，续断15 g，连翘10 g，荔枝核10 g，延胡索10 g，香附10 g，中药饮片购于北京同仁堂(亳州) 饮片有限责任公司。以上中药饮片加10倍蒸馏水，浸泡30 min后加热煮沸，开始用强火，沸腾后改用文火，保持微沸30~60 min，搅拌、趁热滤过，药渣再加蒸馏水，同法煎煮沸后30 min，滤过，合并滤液，经常压浓缩至中药浓度为3.2 kg/L，用蒸馏水稀释调整至所需的浓度灌封备用；阿司匹林泡腾片10片，每片0.5 g，购自阿斯利康制药有限公司(国药准字：H32026201)，将阿司匹林泡腾片溶于5‰羧甲基纤维素钠溶液中，阿司匹林的浓度为2 g/L。
1.3 实验造模菌种鼠衣原体(NiggⅡ)，购自美国ATCC公司，批号VR-123，采用Hela229细胞(购自北京协和细胞资源中心) 培养并繁殖鼠衣原体，使用前测定鼠衣原体感染滴度，于造模前用pH7.4~7.6的衣原体运送培养基(SPG) 稀释至105 IFU/mL备用[8-9]。
1.4 实验仪器及试剂标准规格酶标仪(Thermo Scientific，美国)，自动洗板机(北京拓普分析仪器有限公司，中国)，电热恒温培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司，中国)，低温高速离心机(Eppendorf，德国)，倒置显微镜(Olympus，日本)、全自动血液分析仪(日本希森康美公司，日本)，超净工作台(Thermo，美国)，二氧化碳培养箱(Thermo，美国)。
小鼠1L -17A酶联免疫试剂盒，批号M10027425；小鼠IL-17F酶联免疫试剂盒，批号Ml0027423；小鼠MCP-1酶联免疫试剂盒，批号Ml0026830；小鼠MIP-2酶联免疫试剂盒，批号M1002096；均购自上海酶联生物科技有限公司。
2 实验方法 2.1 造模方法实验小鼠进行2个动情周期(10 d) 的观察后按随机数字表法随机分为：正常组、模型组、阿司匹林组、丹枝饮小剂量组、丹枝饮中剂量组、丹枝饮大剂量组，每组8只小鼠。除正常组，其余各组小鼠均在动情期采用开腹种植鼠衣原体，双侧子宫角各种植20 μL感染滴度为105 IFU/mL的鼠衣原体悬液。造模前和造模后每周每组小鼠均进行全血细胞分析及阴道分泌物衣原体滴度测定确定感染进行的程度。根据白细胞总数及淋巴细胞总数可知感染后1~2周为急性感染期，感染后4周白细胞总数和淋巴细胞总数量恢复正常；感染后5周阴道分泌物衣原体培养为阴性，此时即形成盆腔炎性疾病后遗症模型。预实验时每组随机取2只小鼠处死后取右侧子宫角、右侧输卵管、右侧卵巢进行病理切片，进一步验证模型成功。见表 1。
| 检查项目 | n | 造模前 | 造模后1周 | 造模后2周 | 造模后3周 | 造模后4周 | 造模后5周 |
| 白细胞总数WBC(109/L) | 48 | 10.62±0.76 | 15.96±1.22** | 15.16±0.92** | 11.45±1.26 | 10.70±0.37 | 10.72±1.47 |
| 淋巴细胞总数LYMPH(109/L) | 48 | 7.64±0.52 | 13.53±1.16** | 13.33±0.83** | 10.55±1.17 | 9.88±0.29 | 9.18±1.18 |
| 衣原体滴度(104 IFU/mL) | 48 | 阴性 | 4.62±0.27 | 4.16±0.17 | 3.27±9.14 | 1.83±0.12 | 阴性 |
| 注：与造模前相比，**P < 0.01。 | |||||||
各组小鼠予造模后第6周开始给药，正常组、模型组予5‰的羧甲基纤维素钠溶液0.01 mL/g灌胃；阿司匹林组予阿司匹林溶液(2 g/L) 0.01 mL/g灌胃；丹枝饮小、中、大剂量组分别予丹枝饮(0.8、1.6、3.2 kg/L)0.01 mL/g灌胃；各组均连续灌胃3个动情周期(15 d)。
2.3 指标观察 2.3.1 脸谱疼痛评分各组小鼠予最后1次给药后第2天进行脸谱疼痛评分[10]，单手固定小鼠使其悬空仰伸，取两侧髂前上棘的连线做3等分点，在2个等分点上用棉签深压腹部，持续10 s，观察小鼠面部表情变化。评分依据：1) 眼眶收紧：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)；2) 耸鼻尖：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)；3) 鼓起两腮：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)；4) 耳朵位置：0分(无反应)、1分(直立)、2分(后抻)；胡须摆动：0分(无反应)、1分(轻微)、2分(明显)；取两侧评分相加后的总分进行统计学分析。
2.3.2 血清IL-17A、IL-17F、MCP-1、MIP-2水平各组小鼠予最后1次给药后第2天采取摘眼球取全血，全血4 ℃静置1 h后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清后按照试剂盒操作说明测定血清IL-17A、IL-17F、MCP-1、MIP-2的水平进行统计学分析。
2.4 统计学分析所有各组测量结果用SPSS 18.0软件做统计分析比较，计量资料以均数±标准差(x±s) 表示，组间资料的比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P < 0.05为有统计学意义。
3 实验结果 3.1 丹枝饮对盆腔炎性疾病后遗症(SPID) 小鼠脸谱疼痛评分(MGS) 的影响各组小鼠造模前的脸谱疼痛评分组间分布均衡，各组之间无统计学差异(P＞0.05)。造模给药后，模型组小鼠的脸谱疼痛评分均显著高于正常组、阿司匹林组、丹枝饮小、中、大剂量组(P＜0.01)，提示盆腔炎性疾病后遗症可以导致小鼠慢性盆腔疼痛的形成；且阿司匹林组、丹枝饮小、中、大剂量组与模型组相比均可以有效降低小鼠脸谱疼痛评分(P＜0.01)，治疗后阿司匹林组、丹枝饮小、中剂量组与正常组相比无统计学差异(P＞0.05)。见表 2。
| 分 | ||
| 组别 | n | MGS评分 |
| 正常组 | 8 | 2.125±0.295** |
| 模型组 | 8 | 6.125±0.398## |
| 阿司匹林组 | 8 | 2.750±0.324** |
| 丹枝饮小剂量组 | 8 | 2.625±0.250** |
| 丹枝饮中剂量组 | 8 | 2.250±0.250** |
| 丹枝饮大剂量组 | 8 | 3.000±0.267**# |
| 注：与模型组比较，**P＜0.01；与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | ||
各组小鼠造模给药后，模型组小鼠血清IL-17A水平与正常组比较显著升高(P＜0.01)，其中阿司匹林组、丹枝饮小、中、大剂量组与模型组比较，血清IL-17A水平均有显著降低(P＜0.01)，说明盆腔炎性疾病后遗症可以引起小鼠血清IL-17A水平升高，使用丹枝饮和阿司匹林治疗后均可以有效降低血清IL-17A水平。治疗各组与正常组比较中，丹枝饮中、大剂量组血清IL-17A水平与正常组比较无统计学差异(P＞0.05)，说明丹枝饮中、大剂量组可以有效的降低SIPD小鼠血清IL-17A水平。
各组小鼠造模给药后，模型组小鼠血清IL-17F水平与正常组比较显著升高(P＜0.01)，其中阿司匹林组、丹枝饮小、中、大剂量组与模型组比较，血清IL-17F水平均有显著降低(P＜0.01)，说明盆腔炎性疾病后遗症可以引起小鼠血清IL-17F水平升高，且经过丹枝饮和阿司匹林治疗后均可以有效降低血清IL-17F水平。治疗各组与正常组比较中，丹枝饮小、中剂量组血清IL-17F水平与正常组比较无统计学差异(P＞0.05)，说明丹枝饮小、中剂量组可以有效的降低SIPD小鼠血清IL-17F水平。
各组小鼠造模给药后，模型组小鼠血清MCP-1水平与正常组比较显著升高(P＜0.01)，其中阿司匹林组、丹枝饮小、中、大剂量组与模型组比较，血清MCP-1水平均有显著降低(P＜0.01)，说明盆腔炎性疾病后遗症可以引起小鼠血清MCP-1水平升高，使用丹枝饮和阿司匹林治疗后均可以有效降低SPID小鼠血清MCP-1水平。治疗各组与正常组比较中，丹枝饮小、中、剂量组血清MCP-1水平与正常组比较无统计学差异(P＞0.05)，说明丹枝饮小、中剂量组可以更有效的降低SIPD小鼠血清MCP-1水平。
各组小鼠造模给药后，模型组小鼠血清MIP-2水平与正常组比较显著升高(P＜0.01)，其中阿司匹林组、丹枝饮小、中、大剂量组与模型组比较，血清MIP-2水平均有显著降低(P＜0.01)，说明盆腔炎性疾病后遗症可以引起小鼠血清MIP-2水平升高，使用丹枝饮和阿司匹林治疗后均可以有效降低SPID小鼠血清MIP-2水平。治疗各组与正常组比较中，阿司匹林组、丹枝饮小、中、大剂量组血清MIP-2水平与正常组比较无统计学差异(P＞0.05)，说明阿司匹林、丹枝饮小、中、大剂量均可以有效的降低SIPD小鼠血清MIP-2水平。见表 3。
| ng/L | |||||
| 组别 | n | IL-17A | IL-17F | MCP-1 | MIP-2 |
| 正常组 | 8 | 26.90±0.87** | 2.81±0.33** | 604.11±032.07** | 09.17±0.40** |
| 模型组 | 8 | 57.65±2.27## | 16.96±0.72## | 3 902.59±548.52## | 29.53±3.52## |
| 阿司匹林组 | 8 | 34.44±3.64**# | 4.46±0.67**# | 735.37±017.64**# | 11.24±0.74** |
| 丹枝饮小剂量组 | 8 | 39.47±2.79**## | 4.21±0.80** | 0840.75±062.22** | 11.49±0.89** |
| 丹枝饮中剂量组 | 8 | 26.33±0.79** | 3.56±0.42** | 623.50±052.52** | 9.51±0.46** |
| 丹枝饮大剂量组 | 8 | 34.41±1.66** | 4.81±0.51**# | 1 503.83±164.53**## | 12.06±0.51** |
| 注：与模型组比较，**P＜0.01；与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | |||||
鼠衣原体宫腔种植诱导小鼠盆腔炎性疾病后遗症模型是目前研究盆腔炎性疾病后遗症比较理想的动物模型。经研究表明盆腔炎性疾病后遗症的发生与发展与病原体种类、数量、感染能力密切相关，其中淋球菌和衣原体被公认为引起SPID的致病菌[11-14]。因此本次实验采用鼠衣原体复制盆腔炎性疾病后遗症的模型，且临床盆腔炎性疾病后遗症最主要最常见的临床表现是慢性盆腔痛，本次实验还采用小鼠MGS评分[10]反应小鼠慢性盆腔痛的程度，进一步观察说明丹枝饮对SPID引起的慢性盆腔痛的疗效。
4.2 丹枝饮对SPID小鼠血清炎性因子IL-17A、IL-17F、MCP-1、MIP-2表达水平的影响盆腔炎性疾病后遗症的发病是因为集体在外感的病原体的刺激下，自身免疫系统激活，大量的细胞因子及炎性因子表达、释放、杀伤病原体，在疾病发生发展的过程中炎症因子的异常表达及释放导致内生殖器及盆腔结缔组织的损伤，而损伤的组织进一步促进炎症因子的表达及释放，加重组织损伤，导致本病迁延不愈[15-16]。临床上盆腔炎性疾病后遗症病变组织往往分离不到病原体，患者所感受到的慢性盆腔痛，多是由于PID急性期导致的组织破坏，机体内炎性因子增高，导致盆腔组织粘连而形成，所以，临床上炎性因子可以作为盆腔炎性疾病后遗症观察和治疗的指标。现代实验研究表明，IL-17A与IL-17F是主要的促炎性因子，在由感染、慢性炎症性疾病的炎症反应密切相关，可以诱导多种炎症前因子及趋化因子参与炎症反应[17-19]。MCP-1是一种强有效的趋化细胞因子，是炎症免疫反应的研究热点，大量研究证明，人体内的多种炎症疾病的发生发展都与MCP-1密切相关[20-21]。MIP-2是一种趋化因子，广泛的参与各种炎症反应、免疫应答、血管形成和病毒感染等多种生理和病理过程[22-24]，与炎性疾病息息相关。根据本实验研究的结果，造模后SPID小鼠血清的IL-17A、IL-17F、MCP-1、MIP-2表达水平升高，说明这些炎性因子与盆腔炎性疾病后遗症的发生发展密切相关。
近年来，中医药治疗盆腔炎性疾病后遗症方法颇多，运用化瘀通络法的理论和临床研究，也取得了一定的成果，中医药治疗盆腔炎性疾病后遗症效果明确，且毒副作用较小，可长期使用。导师自创的“丹枝饮”在临床上取得了很好的疗效，其中丹参为君药，活血化瘀，祛瘀止痛；川芎，活血化瘀，其药性辛温香燥，走而不守，又入血分；桑枝，通经络；续断，补肝肾，调血脉，三者共为臣药，与君药配伍，动静相和；延胡索、香附活血行气，通络止痛，连翘、荔枝核共用以平调寒热，同为佐药。诸药合用，共奏化瘀通络之功。本次动物实验研究表明，丹枝饮可有效降低盆腔炎性疾病后遗症小鼠血清IL-17A、IL-17F、MCP-1、MIP-2的表达水平，并且可以有效的改善SPID小鼠慢性盆腔疼痛症状。
综上所述，IL-17A、IL-17F、MCP-1、MIP-2等炎性因子与盆腔炎性疾病后遗症的发生发展密切相关，通过丹枝饮治疗，可有效的降低炎性因子的表达水平，改善盆腔慢性疼痛，达到治疗盆腔炎性疾病后遗症的作用。
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