中药黄芪为豆科（Leguminosae）植物蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao]和膜荚黄芪[A. membranaceus（Fisch.）Bge.]的干燥根，其味甘，性微温，归肺、脾经，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌之功效^[1]。现代药理学研究表明，黄芪具有增强免疫系统功能、抗肿瘤、抗心肌缺血、双向调节血糖，抗菌，抗衰老等活性^[2-9]。

2010版《中华人民共和国药典》黄芪皂苷类的测定为黄芪甲苷的含量测定，采用蒸发光散射检测器^[10]。单一的含量测定方法已经难以全面评价药材的质量，近年来，黄芪指纹图谱的研究取得了一定进展^[11-16]，采用超高效液相色谱/四极杆飞行时间串联质谱仪（UPLC /Q-TOF-MS）^[17]、核磁共振氢谱（1HNMR）^[18]、傅里叶红外光谱（FTIR）^[19]等分析技术能更快，更精准的用于药材质量的鉴别，为黄芪药材及其制剂的质量提供了保证。

为考察黄芪药材质量，本文收集不同批次的黄芪药材，采用2010版药典中的药材提取方法及高效液相-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）分析技术，选择5种黄芪皂苷作为对照品，建立黄芪指纹图谱。文章建立的方法60 min内出共有峰16个，分离度良好，根据对照品指认了5种黄芪皂苷，并对指纹图谱的相似度分析和匹配分析进行研究，从而为提升蒙古黄芪的质量控制水平提供科学依据。

1 实验仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2424 ELSD etector检测器；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius LE225D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；FW80型粉碎机，购自天津泰斯特仪器有限公司；ZDHW型电热套，购自河北黄骅中兴仪器有限公司。黄芪皂苷Ⅰ（H-038-130123）、黄芪皂苷Ⅱ（H-037-120528）、黄芪皂苷Ⅲ（H-036-130123）对照品购自于成都瑞芬思生物科技有限公司；黄芪甲苷（110781-200613）购自于中国药品生物制品鉴定所；异黄芪皂苷Ⅱ为本实验室自制，质量分数均大于98%。黄芪药材由天津市中新药业提供（批号：1005098、08070801、10120303、11041804、11062601、Y1001005、Y1110236、Y1202048、Y1202050、Y1210219、Y1210227、Y1212017）。经天津中医药大学马琳教授鉴定为蒙古黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao]。乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

2 实验方法 2.1 色谱条件

Waters e2695高效液相色谱仪，色谱柱为Grace Apollo C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测器为Waters 2424 ELSD etector；流动相：A纯水-B乙腈梯度洗脱。体积流量1.0 mL/min；漂移管温度60 ℃，雾化器cooling，气压30 psi（2.07 slpm），增益100。见表 1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷4.92 mg、黄芪皂苷Ⅰ9.84 mg、黄芪皂苷Ⅱ5.10 mg、黄芪皂苷Ⅲ4.88 mg、异黄芪皂苷Ⅱ5.12 mg，定容于10 mL甲醇中，以0.22 μm微孔滤膜过滤，作为对照品母液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

黄芪药材60 ℃干燥2 h，粉碎，过60目筛，混合均匀，称取样品4 g，置于索式提取器中，加一定量甲醇浸泡过夜，次日精密加入甲醇至160 mL，加热回流4 h，甲醇减压回收至干，分散于20 mL水中，水饱和正丁醇萃取3次，每次40 mL，合并萃取液，减压回收至干，甲醇复溶，定溶于10 mL容量瓶中，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，待测^[5-6]。

2.4 指纹图谱方法学考察 2.4.1 精密度考察

取同一供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，结果表明，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5%。表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性考察

精密称取同一批黄芪粉末4 g，按“ 2.3”项下方法制备供试品溶液，并在“ 2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样，测定峰面积，计算。测定各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于5%。结果表明黄芪供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性实验

取同一批黄芪样品（11041804）6份，按“ 2.2”项下方法制备供试品溶液，并在“ 2.1”项下色谱条件，重复连续进样6次，测定峰面积，计算。测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5%。表明其重现性良好，符合指纹图谱的要求。

2.5 黄芪指纹图谱的建立

按“2.3”项下方法制备12个不同产地的供试品溶液，进样测定，记录色谱图。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，对12批黄芪样品进行了指纹图谱相似度分析和匹配分析研究，归纳出12批样品的高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱具有30个共有的特征指纹峰，其中17个共有指纹峰的总面积占总峰面积的90%以上并被依次标定，其中7号峰为黄芪甲苷、8号峰为黄芪皂苷Ⅲ、10号峰为黄芪皂苷Ⅱ、11号峰为异黄芪皂苷Ⅱ、12号峰黄芪皂苷Ⅰ，见图 1、图 2。

2.6 12批黄芪药材共有指纹峰峰面积的比值

以12号峰（黄芪皂苷Ⅰ）为内标参照峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积为1，计算其他各共有指纹峰峰面积的比值。见表 2。

3 结果与分析 3.1 相似度计算结果

应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对12批黄芪药材的指纹图谱进行相似度分析，以中位数法生成12批药材的对照图谱，相似度评价结果均大于0.94，证明不同批次间药材比较稳定，结果见表 3。其中6号药材的相似度均比较低，6号药材的3、5、7、8、11号峰含量远远低于其他药材。

3.2 聚类分析

应用SPSS18.0统计软件对12批药材的17个共有峰峰面积进行聚类分析，以17个共有峰为指标，采用Ward Method，利用Euclidean distance作为样品的测度，对数据进行Z得分标准化处理，得到树状聚类图见图 3。从中可以看到，在15处，12批样品分为3大类，样品5，8，9，10为一类，1、2、3、4、6、11、12为一类，7为一类。7号药材1号色谱峰明显高于其他药材的相应色谱峰，2-5，7号色谱峰也略高于其他药材的相应色谱峰，故区别于其他药材，单独聚为一类。

4 讨论

实验中采用药典中的提取方法，便于平行考察不同批次的黄芪药材质量。实验中考查了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液系统，发现甲醇-水系统洗脱时，色谱峰有拖尾现象，乙腈-水系统洗脱时指纹图谱色谱峰多，分离度好，综合考虑乙腈-水系统可以更好的清洗和保护色谱，所以本实验采用乙腈-水系统作为流动相。

中药指纹图谱广泛运用于中药质量研究，常用的分析方法有薄层色谱法（TLC）、HPLC、红外线（IR）等，其中HPLC法应用较广泛。黄芪中的皂苷类成分存在紫外末端吸收的影响，主要采用蒸发光检测器进行测定^[10]。本实验主要针对不同批次黄芪药材进行了研究，其中HPLC-ELSD指纹图谱标定共有峰17个，占总峰面积的90%以上。本实验结果与文献相比^{[14, 16, 20]}，同时结合聚类分析，可以更加直观地对不同批次黄芪药材进行质量评价。文章对黄芪质量标准的建立提供了可靠的依据，且前处理方法简便易行，便于推广。