2017, Vol. 36文章信息
- 魏菲魏菲, 刘斌刘斌, 肖娜肖娜, 曹波曹波, 魏路清魏路清
- WEI Fei, LIU Bin, XIAO Na, CAO Bo, WEI Lu-qing
- 五味子乙素减轻博莱霉素诱导的肺纤维化
- Schizandrin B alleviate bleomyci-induced pulmonary fibrosis
- 天津中医药大学学报, 2017, 36(3): 200-204
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2017, 36(3): 200-204
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2017.03.11
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文章历史
收稿日期: 2017-02-14
2. 中国人民武装警察部队后勤学院附属医院, 天津 300162;
3. 北京市丰台区南苑医院, 北京 100076;
4. 中国人民武装警察部队后勤学院, 天津 300309
2. Hospital Logistics College Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China;
3. Beijing Nanyuan Hospital, Beijing 100076, China;
4. Logistics University of People's Armed Police Force, Tianjin 300309, China
特发性肺纤维化（IPF）是一种以弥漫性肺泡炎和大量成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积所致肺组织结构破坏，肺间质纤维化为特征的疾病[1]。IPF发病较缓，临床确诊后的中位生存时间约为3 a，预后较差[2]。该病的病因和发病机制尚未完全明确，至今没有明显有效的药物，因此关于其药物治疗研究一直是临床研究热点之一。传统中药五味子具有收敛固涩、补肾宁心、止咳平喘等功效[3]。五味子乙素（Sch-B）是从北五味子中提取的有效成分，现代药理研究发现其有保护中枢神经系统、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏等多种药理作用[4-7]。本实验通过博莱霉素构建小鼠肺纤维化模型，观察Sch-B对小鼠肺纤维化的治疗作用，并初探其可能的作用机制，为寻找有效的治疗药物奠定基础。
1 材料 1.1 实验动物昆明种雄性小鼠96只，体质量18~20 g，清洁级，由北京维通利华动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001；实验前适应性喂养1周，饲养条件：室温恒定于22~25 ℃，相对湿度50%~60%，光照时间12 h/d，食物和纯净水可自由摄取。
1.2 药物及试剂注射用盐酸博莱霉素（日本化药株式会社，批号640412，药品进口注册证号H20090885）；地塞米松磷酸钠注射液（天津金耀药业有限公司，生产批号：1304261）；Sch-B（中国药品生物制品研究所110765-200710）；酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国R&D公司）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、谷胱甘肽（GSH）试剂盒、羟脯氨酸（HYP）试剂盒（南京建成工程研究所）；转化生长因子β1（TGF-β1）兔多克隆抗体（ab92486）、磷酸化Smad2（p-Smad2）兔单克隆抗体（ab188334）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）兔单克隆抗体（ab23575）（Abcam公司）；二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
2 方法 2.1 分组及造模96只小鼠随机分为4组：空白对照（N）组，模型（M）组，地塞米松（DM）组，Sch-B组，每组24只。N组气管内滴入0.9%氯化钠注射液，其余各组小鼠经气管给予博莱霉素溶液5 mg/kg建立肺纤维化模型。造模后第2天DM组腹腔注射地塞米松[2 mg/（kg·d）]，连续注射3 d后停药，Sch-B组给予Sch-B灌胃，剂量为60 mg/（kg·d），N组与M组灌等体积橄榄油。
2.2 标本获取与分析于治疗后的第7、14、28天每组分别随机处死8只取材，各组小鼠眼球取血，留取血清做检测，然后脱颈处死快速打开小鼠胸腔，切取右肺中叶4%中性甲醛固定进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色病理切片，剩余肺组织-80 ℃冻存进行相关指标测定。
2.3 肺组织病理学观察观察肺组织形态，参照Szapiel等[8]方法，对肺组织HE染色结果进行肺泡炎症评分，肺泡炎分级及评分标准：0级：无肺泡炎，记0分；1级：轻度肺泡炎，镜下见肺泡隔浸润而增厚，但病变范围不超过全肺20%，肺泡结构未发生明显变化，记1分；2级：中度肺泡炎，肺泡炎症病变面积占全肺的20%~50%，记2分；3级：重度肺泡炎，病变范围超过全肺面积的50%，肺泡腔可见炎性细胞及红细胞，记3分。用Image-ProPlus 6.0软件对Masson染色结果进行图像分析，每张切片随机选取5个不重叠视野（×200），评价肺纤维化程度，肺纤维化程度=肺纤维化面积/肺组织面积×100%。
2.4 测定小鼠血清中白介素-6（IL-6）水平按照试剂盒说明书步骤检测小鼠血清中IL-6水平。
2.5 测定小鼠肺组织SOD、GSH及HYP含量按照试剂盒说明书步骤检测小鼠肺组织SOD、GSH及HYP含量。
2.6 免疫组织化学法测定小鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad2及α-SMA的表达将石蜡切片运用Envision法，用0.01 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCL）修复液进行抗原修复。一抗工作液浓度：TGF-β1兔多克隆抗体、p-Smad2、α-SMA兔单克隆抗体1:100，二抗中杉金桥羊抗兔免疫组化试剂盒。二氨基联苯胺（DAB）显色，常规脱水、透明、中性树脂封片。将免疫组化染色后的所有切片在同一条件下进行拍照分析阳性染色细胞的分布和蛋白的表达情况。200倍光镜下每张切片随机选择5个视野，采用Image-ProPlus 6.0图像分析软件测定每个视野下阳性反应的累积光密度值IOD（sum）和area（sample sum），测得平均光密度值＝IOD（sum）/area（sample sum），以5个视野的平均光密度值的平均值作为该例的测量值，光密度值越大表明目的蛋白表达水平越高。
2.7 统计学处理采用统计软件SPSS 18.0进行分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，呈正态分布时对同一时间点的实验数据进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 小鼠肺组织HE染色及炎症评分见图 1和表 1。N组小鼠各时间点肺泡结构清晰，肺泡间隔正常。M组小鼠肺泡结构破坏，大量炎性细胞浸润，有大量红细胞渗出，肺泡间隔增宽，肺泡炎症评分明显升高，其中以第7天最为严重，第14天炎性细胞浸润开始减少，第28天肺泡炎症有所减轻，但仍有炎性细胞浸润。与M组相比，DM组及Sch-B组各时间点小鼠肺泡结构破坏减轻，肺泡炎症程度减轻（P＜0.05）。
|
| 图 1 肺组织HE染色（×200） |
| 分 | ||||
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 5 | 0.62±0.20 | 0.55±0.15 | 0.57±0.12 |
| M组 | 5 | 2.60±0.39* | 2.49±0.33* | 2.36±0.29* |
| DM组 | 5 | 1.92±0.61*# | 1.80±0.46*# | 1.73±0.36*# |
| Sch-B组 | 5 | 1.89±0.39*# | 1.76±0.29*# | 1.68±0.28*# |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05。 | ||||
与N组比较，M组在第7天没有明显的胶原纤维形成（P＞0.05），在第14天胶原纤维明显增多（P＜0.05），第28天肺间质可见大量绿染的胶原纤维（P＜0.05）。DM组、Sch-B组与M组比较在第7天肺纤维化面积无统计学差异（P＞0.05），在第14天和第28天肺纤维化程度均比M组明显减轻（P＜0.05）。见图 2和表 2。
|
| 图 2 肺组织Masson染色（×200） |
| % | ||||
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 5 | 0.89±0.37 | 0.96±0.29 | 0.91 ±0.15 |
| M组 | 5 | 2.24±0.29 | 6.38±1.71* | 17.27±2.06* |
| DM组 | 5 | 1.93±0.28 | 4.07±1.33*# | 10.82±1.80*# |
| Sch-B组 | 5 | 1.88±0.24 | 3.67±1.34*# | 9.76±1.05*# |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05。 | ||||
见表 3。与N组相比，M组各时间点小鼠血清IL-6含量明显升高，其中在第7天升高幅度最大；与M组比，DM组和Sch-B组小鼠血清IL-6含量均有明显下降（P＜0.05）。
| ng/L | ||||
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 5 | 137.57± 9.49 | 130.14± 9.16 | 127.57±14.30 |
| M组 | 5 | 452.71±46.63* | 400.53±31.11* | 351.46±46.32* |
| DM组 | 5 | 303.66±67.25*# | 260.15±46.60*# | 221.66±21.86*# |
| Sch-B组 | 5 | 329.71±31.25*# | 299.94±36.61*# | 249.92±35.36*# |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05。 | ||||
见表 4。与N组相比，M组各时间点小鼠肺组织SOD含量明显降低，其中在第7天下降幅度最大。与M组相比，DM组和Sch-B组各时间点小鼠肺组织SOD含量均有明显升高（P＜0.05），随时间推移呈逐渐回升趋势，但仍低于正常水平，其中Sch-B组与同时间点DM组相比SOD含量明显升高（P＜0.05），表明Sch-B可以升高肺组织SOD活性水平。
| U/mg | ||||
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 8 | 95.13±13.68 | 93.80± 5.14 | 95.47±6.03 |
| M组 | 8 | 36.50±12.06* | 37.50± 9.03* | 55.83±5.71* |
| DM组 | 8 | 48.61± 7.26*# | 50.61± 8.99*# | 64.38±8.44*# |
| Sch-B组 | 8 | 66.70±13.39*#△ | 67.45±10.62*#△ | 76.63±9.16*#△ |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05；与DM组比较，△P＜0.05。 | ||||
见表 5。M组与N组比较，肺组织GSH含量在第7天降到最低，在第14天和第28天M组GSH含量回升，但仍显著低于N组（P＜0.05）。DM组及Sch-B组各时间点GSH水平均比M组明显升高（P＜0.05）。提示Sch-B可以提高博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺组织中GSH水平。
| μmol/g | ||||
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 8 | 44.51±5.56 | 46.23±8.52 | 48.63±7.17 |
| M组 | 8 | 18.19±5.57* | 18.45±4.59* | 20.17±4.80* |
| DM组 | 8 | 28.21±7.40*# | 29.35±8.47*# | 32.16±7.78*# |
| Sc上-B组 | 8 | 30.84±9.59*# | 30.91±8.81*# | 35.54±9.67*# |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05。 | ||||
与N组相比，M组从第7天TGF-β1蛋白表达量逐渐增加，到第14天达到高峰，第28天表达量有所下降，但仍高于N组（P＜0.05）。Sch-B组比同一时间点M组表达量低（P＜0.05），与DM组比较，Sch-B组在第7天明显降低（P＜0.05）。结果见表 6。
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 5 | 0.001 2±0.000 5 | 0.001 3±0.000 8 | 0.001 6±0.000 6 |
| M组 | 5 | 0.073 3±0.004 7* | 0.080 4±0.003 5* | 0.053 6±0.002 9* |
| DM组 | 5 | 0.063 7±0.006 7*# | 0.072 5±0.006 5* | 0.043 3±0.004 6*# |
| Sch-B组 | 5 | 0.047 1±0.035 7*#△ | 0.053 3±0.002 8*# | 0.042 5±0.004 1*# |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05；与DM组比较，△P＜0.05。 | ||||
见表 7。与N组比较，M组第7天p-Smad2蛋白表达明显增多，在第14天时增至最多，第28天p-Smad2蛋白表达下降，但仍高于正常水平（P＜0.05）。Sch-B组p-Smad2蛋白表达均比同一时间点M组明显降低（P＜0.05）。
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 5 | 0.001 2±0.000 7 | 0.001 0±0.000 5 | 0.0001 3±0.000 3 |
| M组 | 5 | 0.048 2±0.002 3* | 0.056 2±0.001 3* | 0.033 3±0.000 8* |
| DM组 | 5 | 0.038 7±0.001 7* | 0.048 3±0.002 1*# | 0.032 4±0.001 1* |
| Sch-B组 | 5 | 0.035 6±0.002 0*# | 0.039 3±0.0016*#△ | 0.026 7±0.000 6*#△ |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05；与DM组比较，△P＜0.05。 | ||||
见表 8。与N组比较，M组肺纤维化小鼠肺组织中α-SMA蛋白表达从第7天开始明显升高（P＜0.05），至第28天达最大表达量。与M组比，第7天DM组和Sch-B组α-SMA蛋白表达无明显变化（P＞0.05），第14天和第28天DM组和Sch-B组小鼠肺组织中α-SMA蛋白表达均比同一时间点M组表达量明显减少（P＜0.05）。
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 5 | 0.001 2±0.001 1 | 0.001 4±0.000 5 | 0.001 0±0.000 7 |
| M组 | 5 | 0.046 7±0.002 3* | 0.097 0±0.002 4* | 0.121 7±0.001 2* |
| DM组 | 5 | 0.039 7±0.002 0* | 0.074 8±0.001 7*# | 0.082 3±0.002 1*# |
| Sch-B组 | 5 | 0.038 3±0.001 6* | 0.070 7±0.001 1*# | 0.072 0±0.002 4*# |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05。 | ||||
从第7天开始M组及DM组和Sch-B组HYP含量均高于N组（P＜0.05），与M组比较，DM组和Sch-B组HYP含量均低于M组，但没有统计学意义（P＞0.05）；第14、28天与N组比较，M组HYP含量明显增多（P＜0.05），DM组及Sch-B组HYP含量与M组比均明显降低（P＜0.05），表明Sch-B对羟脯氨酸的合成有显著的抑制作用。见表 9。
| μg/g | ||||
| 组别 | n | 第7天 | 第14天 | 第28天 |
| N组 | 8 | 278.25±25.08 | 284.97±38.55 | 276.84±17.10 |
| M组 | 8 | 352.33±24.60* | 492.16±15.73* | 515.61±21.78* |
| DM组 | 8 | 338.99±54.31* | 422.71±41.73*# | 464.07±22.64*# |
| Sch-B组 | 8 | 349.02土44.78* | 428.52±13.05*# | 469.78±11.48*# |
| 注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05。 | ||||
通过病理切片结果发现，与M组比较，Sch-B可以减轻小鼠肺泡炎和肺纤维化程度，说明Sch-B具有一定的肺抗纤维化作用[11]。数据表明虽然Sch-B与地塞米松相比抗炎作用较弱，但其能在减轻机体炎症反应的同时避免了长期应用糖皮质激素的不良反应[12]。实验结果显示Sch-B能明显升高肺组织中SOD和GSH水平，提示其可能通过平衡肺纤维化中的氧化/抗氧化作用来发挥抗肺纤维化的作用[14-15]。
本实验通过免疫组化的方法检测小鼠肺组织TGF-β1和p-Smad2表达水平，结果显示Sch-B可以部分阻滞TGF-β1的生成和Smad2的磷酸化，一定程度上抑制肺纤维化的发展。TGF-β1/Smads通路关系复杂，本研究观察到Sch-B对TGF-β1及其下游的p-Smad2蛋白有影响，提示其可能通过TGF-β1/Smads通路发挥抑制纤维化的作用，下一步将深入研究Sch-B对TGF-β1/Smads通路的影响[16-18]。
结果表明早期肺纤维化形成不明显；第14、28天与M组比，各治疗组HYP含量有明显下降，其中Sch-B组小鼠肺组织中HYP含量降低较为明显，提示纤维化形成主要在中后期，五味子乙素能够减轻肺组织中胶原的形成。肌成纤维细胞是分泌胶原的主要细胞，异常的肌成纤维细胞持续存在是纤维化疾病的标志[19-20]。α-SMA是肌成纤维细胞的表型标志[21]。所以选择α-SMA作为观察肌成纤维细胞的指标。本实验用免疫组化方法检测小鼠肺组织α-SMA蛋白表达，与N组比较，第7天M组及各治疗组α-SMA蛋白表达量明显增加；与M组比较，在相应时间点Sch-B组α-SMA蛋白表达有所降低，说明Sch-B能够部分抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。
综上所述，Sch-B可以通过减轻炎症反应，提高肺组织的抗氧化水平，降低TGF-β1、p-Smad2表达来抑制肺纤维化的进程，减轻肺纤维化的程度。但是Sch-B抗氧化作用与抑制TGF-β1/Smads通路之间是否相关还不明确，深入研究其作用机制将为其应用于肺纤维化治疗奠定理论基础。
| [1] | 魏路清, 董彦. 肺纤维化发病机制及治疗策略的新观念[J].国外医学·呼吸系统分册, 2003, 23(1): 38–41. |
| [2] | Raghu G, Collard HR, Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidence-based guidelines for diagnosis and management[J].Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183(6): 788–824. DOI:10.1164/rccm.2009-040GL |
| [3] | 高学敏. 中药学[M]. 北京: 中国中医药出版社, 2007 |
| [4] | 谢云亮. 五味子有效成分分离纯化及对记忆障碍模型小鼠学习记忆的影响[D]. 长春: 吉林大学, 2013. |
| [5] | 胡中莲, 孟祥辉. 五味子乙素对巨噬细胞炎症相关介质表达的影响[J].中国实验诊断学, 2014, 18(1): 25–27. |
| [6] | 刘晓阳, 王立波, 侯晓节, 等. 五味子乙素抑制胶质瘤生长的作用[J].中国老年学杂志, 2013, 23(17): 4176–4177. DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2013.17.034 |
| [7] | 朱艳, 王俊平. 五味子乙素对丙戊酸钠肝脏损伤的保护作用[J].中国中西医结合儿科学, 2012, 4(5): 405–406. |
| [8] | Szapiel SV, Elson NA, Fulmer JD, et al. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis, 1979, 120(4): 893–899. |
| [9] | 张德平. 特发性肺纤维化药物治疗现状与对策[J].中华结核与呼吸杂志, 2013, 36(11): 844–847. |
| [10] | 蔡后荣, 张湘燕, 李惠萍. 实用间质性肺疾病[M]. 第2版. 北京: 人民卫生出版社, 2016 |
| [11] | Liu B, Cao B, Zhang D, et al. Salvianolic acid B protects against paraquat-induced pulmonary injury by mediating Nrf2/Nox4 redox balance and TGF-beta1/Smad3 signaling[J].Toxicol Appl Pharmacol, 2016, 309: 111–120. DOI:10.1016/j.taap.2016.08.004 |
| [12] | Le TT, Karmouty-Quintana H, Melicoff E, et al. Blockade of IL-6 Trans signaling attenuates pulmonary fibrosis[J].J Immunol, 2014, 193(7): 3755–3768. DOI:10.4049/jimmunol.1302470 |
| [13] | 钟长军, 李琳, 李俊, 等. 氧化应激在特发性肺纤维化中的作用及其机制研究进展[J].中国药理学通报, 2012, 28(2): 169–172. |
| [14] | 阎小燕, 韩佳, 朱雪, 等. 活血药对肺纤维化模型大鼠肺组织超氧化物歧化酶和谷胱甘肽表达的影响[J].山东中医杂志, 2015, 34(12): 941–943. |
| [15] | 朱秀敏. 超氧化物歧化酶的生理活性[J].当代医学, 2011, 17(15): 26–27. DOI:10.3969/j.issn.1009-4393.2011.15.017 |
| [16] | 刘理静, 钱红, 张平. 大黄素对肺纤维化大鼠的保护作用及部分机制研究[J].中国药理学通报, 2015, 31(2): 266–272. |
| [17] | Lin C, Rezaee F, Waasdorp M, et al. Protease activated receptor-1 regulates macrophage-mediated cellular senescence:a risk for idiopathic pulmonary fibrosis[J].Oncotarget, 2015, 6(34): 35304–35314. |
| [18] | 杨雅茹, 黄艳, 李俊. TGF-β1介导的Smads与ERK通路在肺纤维化中的作用及相互关系[J].中国药理学通报, 2010, 26(5): 561–563. |
| [19] | 杨礼腾, 刘欣, 程德云, 等. 迷迭香二萜芬提取物对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1及其信号通路分子mRNA表达的影响[J].中国中西医结合杂志, 2013, 33(6): 819–824. |
| [20] | 侯燕, 冯一中, 蒋小岗, 等. 沙苑子总黄酮对博莱霉素致大鼠肺纤维化的干预作用及其机制研究[J].中国药理学通报, 2013, 29(1): 88–93. |
| [21] | 夏永良, 王媛, 杨珺超, 等. 补肺汤对肺纤维化大鼠肺组织成纤维细胞α-SMA表达的影响[J].中华中医药学刊, 2014, 32(8): 1916–1918. |