髌腱炎是以肌腱组织内胶原合成紊乱为主要病理特征的肌腱病^[1]，髌腱炎的发病与肌腱组织的高强度、反复应力载荷有关^[2-3]。转化生长因子β1（TGF-β1）的表达受应力调控^[4]，TGF-β1通过经典信号转导途径激活下游Smad、腱调蛋白（Tnmd），调控肌腱干细胞（TSCs）的生长、迁移、分化以修复损伤肌腱^[5]。TGF-β1超家族在哺乳动物中有3类亚型，TGF-β1能够促进间质细胞增殖、调节TSCs表型。TGF-β1通过其受体磷酸化激活Smad2产生生物效应^[6]，TGF-β1对Smad2的调控受自身反馈调节机制影响，这种调节机制的紊乱会引发TGF-β1的持续活化，进而产生病理性堆积，有研究表明，TGF-β1高浓度、长时间的刺激会诱导体外培养的TSCs成骨分化^[7]，因此TGF-β1的浓度调控是应力导致肌腱损伤的重要因素，亦是物理治疗发挥作用的主要途径。Tnmd是Ⅱ型跨膜蛋白，亦是除TGF-β1外调控TSCs分化行为的重要细胞因子，Docheva等^[8]发现Tnmd敲除小鼠的腱细胞增殖能力明显下降，Tnmd是TSCs成肌腱细胞分化的标志，在体外培养的TSCs中，过表达TGF-β1能够上调Tnmd的表达，但在软骨细胞中没有这种现象，表明TGF-β1对Tmnd的调节作用是具有肌腱特异性的^[9]。

推拿手法是单一外源性物理刺激因素，施术者手法应力作用与患病组织的生物应答可有效提高物理治疗对肌腱局部的作用^[10-11]。相比临床常用的局部抗炎治疗和机械康复治疗，推拿手法具有独特的优势，基于此笔者运用屈膝点按叩揉法与局部糖皮质激素注射及持续被动运动（CPM）治疗比较，分析屈膝点按叩揉法对TSCs成肌腱分化相关通路蛋白的影响，探讨该手法对髌腱炎损伤修复的机制。

1 材料和方法 1.1 试剂

LG-DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素、链霉素（Gibco公司，美国）；Ⅰ型胶原酶、地塞米松（Sigma公司，美国）；RNA提取试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（QRT-PCR）试剂盒、5×RNA Loading Buffer（Takara公司，日本）。

1.2 仪器

手指关节CPM治疗仪（常州康达康复设备有限公司，中国）；电子天平（Sartorius公司，德国）；制冰机（Scotsman公司，美国）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，美国）；iCycler荧光定量PCR仪、电泳系统（Bio-Rad公司，美国）；低温离心机（Eppendorf公司，德国）。

1.3 实验动物及造模

SPF级SD大鼠50只[SCXK-（军）2009-003]，雌雄各半，体质量（250±20）g。光照12 h，温度（23±2）℃，湿度40%~70%饲养。将50只大鼠编号后按随机数字表法随机分为5组，分别为正常组、模型组、CPM组针剂组及治疗组，每组10只。造模后治疗组采用屈膝点按叩揉法治疗，针剂组采用局部糖皮质激素注射治疗，CPM组运用CPM治疗仪治疗，模型组及正常组同条件饲养。

造模方法：将大鼠以2.5%戊巴比妥（4.5 mg/kg）麻醉，双侧下肢常规备皮。大鼠仰卧位固定，过屈膝关节使髌腱处于紧张状态。髌骨下极髌韧带两侧注射20 μLⅠ型胶原酶，多次活动膝关节使韧带与胶原酶充分接触，2周后按分组进行处理^[12]。

1.4 治疗方法

治疗组参考文献[13-14]方法：用固定器包裹大鼠上半身及前肢，先以指揉法施术于大鼠股四头肌，重点在髌骨上部，约2 min，并按揉鹤顶、血海、梁丘、伏兔等穴，每穴0.5 min，同时以按揉与弹拨法交替作用在髌韧带，重点在髌骨下极髌韧带附着点，并提拿髌骨，使大鼠患肢屈髋屈膝，术者手持小腿远端，作屈膝摇法，配合膝关节的屈伸、旋转等被动活动。操作者在髌韧带两侧施擦法30 s，结束手法。以上手法治疗每日1次，7 d为1个疗程，共治疗3个疗程。针剂组：采用30 mg曲安奈德加1 mL利多卡因在患肢髌骨下极髌腱附着处浸润注射，每周1次，共治疗3周。CPM组：大鼠俯卧位固定于拉伸平台，将CPM治疗仪置于大鼠患侧膝关节外侧，固定踝关节，使膝关节与机械臂平行放置，设定起始角度0°终止角度为50°，每秒4°，40 s为1个周期，每次5 min。每日治疗1次，共治疗21 d。

1.5 蛋白免疫印迹法（Western Blot法）检测

颈髓离断处死大鼠，将5组髌腱组织研磨后按每20 mg组织加200~400 μL的比例加入裂解液，匀浆约1 min或直至充分裂解。12 000转离心10 min，取上清，用考马斯亮蓝法测定各组样本蛋白含量。将蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据蛋白定量结果加入蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，95 ℃变性10 min，将样品加入凝胶孔中，浓缩胶6%与分离胶8%，电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。半干转膜：100%甲醇浸泡PVDF膜3 min，电转液漂洗2次，裁剪样品胶，转膜夹板夹好，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中，130 mV，30 min，转印后，封闭1 h，加一抗4 ℃反应过夜，TBST洗涤3次，加入二抗1 h，TBST洗膜，曝光、洗片，image J软件分析灰度值，通过灰度分析比较TGF-β1、Smad-2、Tnmd、胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ)在5组肌腱组织中的表达情况。

1.6 实时荧光定量

检测各组肌腱组织TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ的表达，用超纯RNA提取试剂提取组织样本中总RNA，取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性，将RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上备用，向反应管中加入20 μL反应体系进行反转录，用ABI 7500型荧光定量PCR仪，设定反应条件为：预变性：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。每对引物设3个复孔。结果用ABI PRISM 7500分析，引物：TGF-β1-F（5’-CCACGGAGAGGAAATAGA-3’），TGF-β1-R（5’-ATGAGGAGCAGGAAGGGT-3’），Smad-2-F（5’-ATAGGTGGGGAAGTTTTTGC-3’），Smad-2-R（5’-TTGAGATTACAGCCTGGTGG-3’），Tnmd-F（5’-TCATA-GGTTTTTTTGGGTGT-3’），Tnmd-R（5’-TGAGAG-AGGTTACTGTTGT-3’），COL-1-F（5’-AGCATGTC-TGGTTAGGAG-3’），COL-1-F（5’-ATGAAGGCAA-GTTGGGTA-3’）。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件包对数据进行统计学分析，计量资料使用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Western Blot法检测结果

各组肌腱组织中均有TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达，通过灰度分析后结果表明：正常组TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），治疗组、针剂组、CPM组TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达均高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），治疗组TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达高于针剂组、CPM组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。

2.2 定时荧光定量PCR检测结果

各组肌腱组织提取总RNA，定时荧光定量PCR检测TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达，实验重复3次。结果表明，正常组TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），治疗组、针剂组、CPM组TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达均高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），治疗组TGF-β1、Smad-2、Tnmd、CollagenⅠ蛋白的表达高于针剂组、CPM组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

3 结论

屈膝点按叩揉法、局部糖皮质激素注射及CPM治疗均可以上调肌腱组织内的TGF-β1、Smad-2、Tnmd蛋白的表达，进而促进TSCs成肌腱细胞分化，对损伤肌腱组织起到修复作用，屈膝点按叩揉法对腱分化标志蛋白Ⅰ型胶原合成的促进作用最为突出，笔者推测屈膝点按叩揉法通过影响TGF-β1/Smad-2/Tnmd蛋白通路进而上调CollagenⅠ的表达，TGF-β1的应力依赖性是推拿手法发挥作用的主要原因。

4 讨论

膝关节作为人体最大、最复杂的承重关节，髌腱对膝关节的运动和稳定起到重要作用，髌腱炎一旦发病将严重影响下肢活动。研究表明，高强度、高频率的循环牵伸或长时间的应力静载可以导致肌腱的微损伤^[15]，这种损伤的机制可能与白介素-1β（IL-1β）以及基质金属蛋白酶（MMPs）的参与有关^[16]，这使得抗炎治疗在髌腱炎早期的干预中取得较好的疗效。但受损肌腱组织内的胶原纤维紊乱会大幅降低肌腱的力学性能，当组织再次机械载荷时受损局部会产生剪切应力而加重肌腱损伤，反复的微损伤会诱导TSCs成骨分化^[17]，而肌腱的修复主要依赖肌腱组织内TSCs的内源性愈合^[18]。因此，治疗髌腱炎不仅要控制炎症，更要有效修复肌腱微损伤，恢复肌腱组织的力学性能。推拿手法通过外源性应力刺激调节肌腱组织的应力环境，从整体调节入手，在防治肌腱微损伤、恢复肌腱功能方面取得良好疗效，屈膝点按叩揉法在此基础上强调“以动为主，动静结合”的原则，根据患者病情和疾病的病理状态决定作用力的强弱、节奏的快慢、动作的徐急和幅度的大小，“机触于外，巧生于内，手随心转，法从手出”，通过施术者的体会结合患者的肌肉响应选择合适的作用力度，确保手法在合理的范围内调节肌腱功能。

生物力学的等效药理作用在运动系统疾病的机制研究中逐渐得到重视，屈膝点按叩揉法根据膝关节的应力结构和髌腱的材料特性，通过适当的拉伸载荷和针对腱骨端的应力干预调控腱骨端TSCs的分化活性^[19]。屈膝点按叩揉法防治髌腱炎在临床取得了满意疗效，通过分析该手法对TSCs成肌腱分化相关蛋白的影响探讨其作用机制。笔者发现，屈膝点按叩揉法能够调控TGF-β1、Smad2促进TSCs成腱分化，修复髌腱组织微损伤。但屈膝点按叩揉法调控TGF-β1/Smad信号通路的启动机制尚不明确，未来将通过压力钳技术进一步探讨肌腱细胞力学-生物信号转导机制，为增强手法治疗的靶向作用、提高临床疗效提供新的研究思路。