天津中医药大学学报  2017, Vol. 36 Issue (3): 209-213

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屠亚茹屠亚茹, 欧阳慧子欧阳慧子, 孙梦杰孙梦杰, 常艳旭常艳旭, 何俊何俊
TU Ya-ru, OUYANG Hui-zi, SUN Meng-jie, CHANG Yan-xu, HE Jun
UPLC-Q-TOF-MS/MS方法鉴定血必净注射液中20种化学成分
Simultaneous identification of 20 components in Xuebijing injection by UPLC—Q—TOF-MS/MS
天津中医药大学学报, 2017, 36(3): 209-213
Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2017, 36(3): 209-213
http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2017.03.13

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收稿日期: 2017-01-03
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屠亚茹, 欧阳慧子, 孙梦杰, 常艳旭, 何俊. UPLC-Q-TOF-MS/MS方法鉴定血必净注射液中20种化学成分[J]. 天津中医药大学学报, 2017, 36(3): 209-213.
TU Ya-ru, OUYANG Hui-zi, SUN Meng-jie, CHANG Yan-xu, HE Jun. Simultaneous identification of 20 components in Xuebijing injection by UPLC—Q—TOF-MS/MS[J]. Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2017, 36(3): 209-213.
UPLC-Q-TOF-MS/MS方法鉴定血必净注射液中20种化学成分
屠亚茹1, 欧阳慧子2, 孙梦杰1, 常艳旭1, 何俊1     
1. 天津中医药大学中医药研究院, 天津市现代中药重点实验室, 天津 300193;
2. 天津中医药大学第一附属医院, 天津 300193
收稿日期: 2017-01-03
基金项目: 国家自然科学基金项目资助（81303140）
作者简介: 屠亚茹(1991-), 女, 硕士研究生, 研究方向为药物分析。
通讯作者: 何俊, E-mail:hejun673@163.com。
摘要: 目的 利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）对血必净注射液中的化学成分进行快速鉴定。 方法 采用ACQUITY UPLC® BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，在负离子模式下进行数据采集，通过与对照品对比保留时间、相对分子量、二级质谱碎片离子的方法确定化学成分。 结果 在负离子模式下，45 min内鉴定出血必净注射液中20种化学成分。 结论 建立了一种简单、准确的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法对血必净注射液中的化学成分进行鉴定。
关键词: 血必净注射液     UPLC-Q-TOF-MS/MS     定性分析    
Simultaneous identification of 20 components in Xuebijing injection by UPLC—Q—TOF-MS/MS
TU Ya-ru1, OUYANG Hui-zi2, SUN Meng-jie1, CHANG Yan-xu1, HE Jun1     
1. Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine, Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;
2. The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Abstract: Objective To develop a UPLC-Q-TOF-MS/MS method for simultaneous identification of 20 components in Xuebijing injection. Methods The method of qualitative analysis was performed on ACQUITY UPLC® BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) column with a gradient mobile phase system of acetonitrile and 0.1% formic acid.All of the analytes were identified in negative ionization.According to the high resolution MS spectra data, fragmentation ion information andretention time, 20 peaks were identified by comparison with reference standards data. Results Twenty components were identified in 45 min. Conclusion The established method for the identification of chemical constituents in Xuebijing injection is simple and accuracy.
Key words: Xuebijing injection     UPLC-Q-TOF-MS/MS     qualitative analysis    

血必净注射液是由王今达教授以血府逐瘀汤组方为基础研制的复方中药制剂[1]，由红花、赤芍、川芎、丹参、当归5味中药组成，其有效成分包括红花色素、黄酮苷、酚酸和苯乙基苷等[2]。研究表明，血必净注射液具有降低内毒素水平、调节免疫及炎性介质的作用[3-4]，临床上主要用来治疗脓毒症和多器官功能障碍综合症[5-10]，并可与抗生素联合用药用于治疗肺部感染[11]。

在以往的研究当中，对于血必净注射液的研究多集中于药理、药效方面，而有关药效成分的研究则相对较少。虽然已有相关文献对血必净注射液的化学成分进行了定量分析[2]，但所采用的方法不够简单、灵敏，且所分析的化学成分相对较少。目前，对化学成分的分析方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、超高夜相色谱法（UPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC/MS）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC/MS）、超高液相色谱-质谱联用法（UPLC/MS），通过液质联用技术可以得到化合物的分子量、元素组成以及离子碎片等信息，对确定化合物的结构有重大意义。本实验建立了简便、灵敏的超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）定性分析方法，最终确定了血必净注射液中的20种化学成分，对丰富血必净注射液化学成分的研究以及确定其药效成分提供了参考。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪；Agilent Q-TOF 6520质谱仪（美国Agilent公司）；Agilent MassHunter分析软件（美国Agilent公司）；AX205型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水制备仪（Millipore公司）；3K15型高速离心机（美国Sigma公司）；XW-80A型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 试药

对照品羟基红花黄色素A（批号MUST-12081605），芍药苷（批号MUST-16041901），芍药内酯苷（批号MUST-15091008），氧化芍药苷（批号MUST-15033010），苯甲酰芍药苷（批号MUST-15091010），阿魏酸（批号MUST-15091605），没食子酸（批号MUST-15042910），丹参素（批号MUST-15082714），绿原酸（批号MUST-15041814），丹酚酸A（批号MUST-15072110），丹酚酸C（批号MUST-15011305），金丝桃苷（批号MUST-16032113），迷迭香酸（批号MUST-16040512），购自成都曼斯特生物科技有限公司。咖啡酸（批号110885-200102），原儿茶酸（批号110809-200604），原儿茶醛（批号110810-201007），购自中国食品药品检定研究院。鸟苷（批号XMM0662），尿苷（批号XMM0664），洋川芎内酯I（批号2015039），购自天津士兰科技有限公司。血必净注射液购自天津红日药业股份有限公司，乙腈（美国Merck公司）、甲酸（美国ROE公司）为色谱纯。

2 方法 2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为：0~2 min，5%~15% B；2~4 min，15%~15% B；4~5 min，15%~18% B；5~12 min，18%~18% B；12~13 min，18%~20% B；13~15 min，20%~20% B；15~16 min，20%~21% B；16~18 min，21%~21% B；18~19 min，21%~22% B；19~24 min，22%~25% B；24~28 min，25%~50% B；28~34 min，50%~70% B；34~39 min，70%~85% B；39~43 min，85%~100% B；43~45 min，100%~100% B；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，负离子模式监测，毛细管温度：350 ℃；干燥气流速：9 L/min；雾化器压力：30 psi；碎裂电压：175 V；碰撞能量：8 V，35 V。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取羟基红花黄色素A、原儿茶醛、原儿茶酸、迷迭香酸、咖啡酸、没食子酸、阿魏酸、绿原酸、丹参素、芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、鸟苷、尿苷、金丝桃苷、没食子酰芍药苷、洋穿芎内酯I、丹酚酸A、丹酚酸C对照品各1 mg，用甲醇溶解，配制为1 mg/mL的对照品储备溶液。4 ℃冰箱冷藏备用。

2.4 供试品溶液的制备

血必净注射液用超纯水稀释10倍，经0.22 μm微孔滤膜过，即得。

3 结果与分析

采集负离子模式下的总离子流图，见图 1。利用Agilent Masshunter Qualitative Analysis分析软件，对负离子模式下采集的血必净注射液总离子流图进行提取，根据准离子分子峰，确定化合物的分子量和分子式，结合二级质谱碎片，并对比对照品进行鉴定。结果见表 1。

图 1 血必净负离子模式下总离子流图
图选项
表 1 血必净UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定结果
编号 保留时间tR(min) 监测离子 MS(m/z) MS2碎片(m/z) 分子式 化合物
1 1.409 [M-H]- 243.062 8 200.060 4、185.994 1 C9H12N2O6 尿苷
2 1.579 [M-H]- 283.079 2 150.040 0 C10H13N5O5 鸟苷
3 1.974 [M-H]- 169.001 3 125.010 9 C7H6O5 没食子酸
4 2.777 [M-H]- 197.044 5 179.031 7 C9H10O5 丹参素
5 3.158 [M-H]- 153.0186 109.030 7 C7H6O4 原儿茶酸
6 3.810 [M-H]- 495.149 6 137.023 5 C23H28O12 氧化芍药苷
7 3.931 [M-H]- 137.025 7 108.028 7 C7H6O3 原儿茶醛
8 4.072 [M-H]- 353.088 9 191.056 2 C16H18O9 绿原酸
9 4.589 [M-H]- 179.033 5 135.044 0 C9H8O4 咖啡酸
10 4.927 [M-H]- 611.1699 491.120 0 C27H32O16 羟基红花黄色素A
11 5.173 [M+HCOO]- 525.1611 479.154 8, 283.080 2, 121.029 7 C23H28O11 芍药内酯苷
12 5.951 [M+HCOO]- 525.1614 479.154 4、449.144 2、327.107 5、165.055 4、121.028 4 C23H28O11 芍药苷
13 6.882 [M-H]- 193.049 8 149.059 9、134.036 7 C10H10O4 阿魏酸
14 7.086 [M-H]- 631.1683 613.157 6、509.135 9、491.119 7、399.095 1、313.057 2 C30H32O15 没食子酰芍药苷
15 7.143 [M-H]- 463.088 6 302.033 2, 301.033 2, 300.020 9 C21H20O12 金丝桃苷
16 10.686 [M-H]- 359.076 3 197.045 5, 179.035 9^161.023 1 C18H16O8 迷迭香酸
17 12.185 [M-H]- 223.096 8 205.086 4、187.063 3、179.090 0、161.095 4、112.986 3 C12H16O4 洋川芎内酯I
18 22.740 [M-H]- 493.1119 295.219 0 C26H22O10 丹酚酸A
19 28.665 [M-H]- 583.1768 553.168 4、535.181 0、431.129 2、121.029 4 C30H32O12 苯甲酰芍药苷
20 29.173 [M-H]- 491.286 2 311.047 5、293.0502 C26H20O10 丹酚酸C
表选项

以咖啡酸为例，咖啡酸的EIC图及二级质谱图见图 2。

图 2 咖啡酸的EIC图及二级质谱图
图选项

化合物1：tR=1.409 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=243.062 8，二级裂解产生m/z=200.060 4、185.994 1。对照品tR=1.411 min，裂解规律为m/z=243.062 8 [M-H]-，二级扫描裂解产生200.055 0[M-H-CONH]-。分子式为C9H12N2O6，相对分子质量为244.069 5，对比对照品鉴定化合物1为尿苷。

化合物2：tR=1.579 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=282.079 2，二级裂解产生m/z=150.040 0。对照品tR=1.612 min，裂解规律为m/z=282.079 2[M-H]-，二级扫描裂解产生150.041 7[M-H-C5H8O4]-。分子式为C10H13N5O5，相对分子质量为283.091 7，对比对照品鉴定化合物2为鸟苷。

化合物3：tR=1.974 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=169.001 3，二级裂解产生m/z=125.010 9。对照品tR=1.967 min，裂解规律为m/z=169.001 7[M-H]-，二级扫描裂解产生125.024 0[M-H-CO2]-。分子式为C7H6O5，相对分子质量为170.011 5，对比对照品鉴定化合物3为没食子酸。

化合物4：tR=2.777 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=197.044 5，二级裂解产生m/z=179.031 7。对照品tR=2.812 min，裂解规律为m/z=197.044 6[M-H]-，二级扫描裂解产生179.034 2[M-H-H2O]-。分子式为C9H10O5，相对分子质量为198.052 8，对比对照品鉴定化合物4为丹参素。

化合物5：tR=3.158 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=153.018 6，二级裂解产生m/z=109.030 7，对照品tR=3.177 min，裂解规律为m/z=153.018 5[M-H]-，二级扫描裂解产生109.029 1[M-H-CO2]-。分子式为C7H6O4，相对分子质量为154.026 6，对比对照品鉴定化合物5为原儿茶酸。

化合物6：tR=3.810 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=495.149 6，二级裂解产生m/z=137.023 5，对照品tR=3.813 min，裂解规律为m/z=495.149 7[M-H]-，二级扫描裂解产生137.023 7[M-H-C16H22O9]-。分子式为C23H28O12，相对分子质量为496.158 1，对比对照品鉴定化合物6为氧化芍药苷。

化合物7：tR=3.931 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=137.025 7，二级裂解产生m/z=108.028 7，对照品tR=3.927 min，裂解规律为m/z=137.025 9[M-H]-，二级扫描裂解产生108.021 2[M-H-HCO]-，分子式为C7H6O3，相对分子质量为138.031 7，对比对照品鉴定化合物6为原儿茶醛。

化合物8：tR=4.072 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=353.088 9，二级裂解产生m/z=191.056 2，对照品tR=4.099 min，裂解规律为m/z=353.087 8[M-H]-，二级扫描裂解产生191.055 8[M-H-CH2O]-，分子式为C16H18O9，相对分子质量为354.095 1，对比对照品鉴定化合物8为绿原酸。

化合物9：tR=4.589 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=179.034 2，二级裂解产生m/z=135.044 3，对照品tR=4.581 min，裂解规律为m/z=179.034 5[M-H]-，二级扫描裂解产生135.044 7[M-H-CO2]-，分子式为C9H8O4，相对分子质量为180.042 3，对比对照品鉴定化合物9为咖啡酸。

化合物10：tR=4.927 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=611.169 9，二级裂解产生m/z=491.120 0，对照品tR=4.881 min，裂解规律为m/z=611.168 7[M-H]-，二级扫描裂解产生491.118 7[M-H-C8H8O]-，分子式为C27H32O16，相对分子质量为612.169 0，对比对照品鉴定化合物9为羟基红花黄色素A。

化合物11：tR=5.173 min，一级产生[M+HCOO]-峰，m/z=525.161 1，二级裂解产生m/z=479.154 8、283.080 2、121.029 7。对照品tR=5.159 min，裂解规律为m/z=525.161 2[M+HCOO]-，二级扫描裂解产生479.155 4[M-H]-、121.029 1[C8H9O]-。分子式为C23H28O11，相对分子质量为480.163 2，对比对照品鉴定化合物11为芍药内酯苷。

化合物12：tR=5.951 min，一级产生[M+HCOO]-峰，m/z=525.160 4，二级裂解产生m/z=479.154 4、449.144 2、327.107 5、165.055 4、121.028 4。对照品tR=5.957 min，裂解规律为m/z=525.160 5[M+HCOO]-，二级扫描裂解产生479.155 7[M-H]-、449.145 4 [M-H-COH2]-、327.108 3[M-H-COH2-C7H6O2]-、165.054 9、121.029 2[C8H9O]-，分子式为C23H28O11，相对分子质量为480.163 2，对比对照品鉴定化合物12为芍药苷。

化合物13：tR=6.882 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=193.049 8，二级裂解产生m/z=149.059 9、134.036 7。对照品tR=6.878 min，裂解规律为m/z=193.050 3[M-H]-，二级扫描裂解产生149.060 4 [M-H-CO2]-、134.036 9[M-H-CO2-CH3]-，分子式为C10H10O4，相对分子质量为194.057 9，对比对照品鉴定化合物13为阿魏酸。

化合物14：tR=7.086 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=631.168 3，二级裂解产生m/z=613.157 6、509.135 9、491.119 7、399.095 1、313.057 2。对照品tR=7.100 min，裂解规律为m/z=631.168 3[M-H]-，二级扫描裂解产生613.168 3[M-H-H2O]-、491.118 8[M-H-H2O-C7H6O2]-、313.056 7[M-H-H2O-C7H6O2-C10H9O3]-，分子式为C30H32O15，相对分子质量为632.174 1，对比对照品鉴定化合物12为没食子酰芍药苷。

化合物15：tR=7.143 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=463.088 6，二级裂解产生m/z=302.033 2[M-H-C6H9O5]-、301.033 2、300.020 9。对照品tR=7.145 min，裂解规律为m/z=463.088 2[M-H]-，二级扫描裂解产生302.038 0[C6H11O5]-、301.034 3、300.027 2，分子式为C21H20O12，相对分子质量为464.095 5，对比对照品鉴定化合物15为金丝桃苷。

化合物16：tR=10.686 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=359.076 3，二级裂解产生m/z=197.045 5、179.035 9、161.023 1。对照品tR=10.692 min，裂解规律为m/z=359.076 9[M-H]-，二级扫描裂解产生197.044 5[M-H-C9H6O3]-、179.033 8[M-H-C9H6O3-H2O]-、161.023 6[M-H-C9H6O3-H2O-H2O]-，分子式为C18H16O8，相对分子质量为360.084 5，对比对照品鉴定化合物16为迷迭香酸。

化合物17：tR=12.185 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=223.096 8，二级裂解产生m/z=205.086 4、187.063 3、179.090 0、161.095 4、112.986 3。对照品tR=12.212 min，裂解规律为m/z=223.096 4[M-H]-，二级扫描裂解产生205.085 1[M-H-H2O]-、187.082 6[M-H-H2O-H2O]-，分子式为C12H16O4，相对分子质量为224.104 9，对比对照品鉴定化合物17为洋川芎内酯I。

化合物18：tR=22.740 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=493.111 9，二级裂解产生m/z=295.219 0。对照品tR=22.738 min，裂解规律为m/z=493.111 9[M-H]-，二级扫描裂解产生295.217 9[M-H-C9H10O5]-。分子式为C26H22O10，相对分子质量为494.121 3，对比对照品鉴定化合物18为丹酚酸A。

化合物19：tR=28.665 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=583.176 8，二级裂解产生m/z=553.168 4、535.181 0、431.129 2、121.029 4。对照品tR=28.738 min，裂解规律为m/z=583.176 9[M-H]-，二级扫描裂解产生m/z=121.029 4[C8H9O]-。分子式为C30H32O12，相对分子质量为584.189 4，对比对照品鉴定化合物19为苯甲酰芍药苷。

化合物20：tR=29.173 min，一级产生[M-H]-峰，m/z=491.186 2，二级裂解产生m/z=311.047 5、293.050 2。对照品tR=29.179 min，裂解规律为m/z=491.186 1[M-H]-，二级扫描裂解产生293.045 0[M-H-C9H10O5]-。分子式为C26H20O10，相对分子质量为492.105 6，对比对照品鉴定化合物20为丹酚酸C。

3 讨论

实验分别考察了乙腈-水、乙腈-水（0.1%甲酸）作为流动相，结果表明当乙腈-水（0.1%甲酸）作为流动相时，电离效果更好。电喷雾质谱法（ESI-MS）定性分析时，分别采用正、负离子全扫描以获得更多的离子信息，结果表明负离子监测模式下目标物质的响应值明显，而正离子检测信息量少，故选择负离子模式进行分析。

对血必净注射液中的化学成分进行定性分析，根据相对分子质量信息和二级质谱碎片的裂解规律并与对照品进行对比，共鉴定出包括羟基红花黄色素A、芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、阿魏酸、没食子酸、丹参素、绿原酸、丹酚酸A、丹酚酸C、金丝桃苷、迷迭香酸、咖啡酸、原儿茶酸、原儿茶醛、鸟苷、尿苷和洋川芎内酯I在内的20个化合物。该方法与传统液相方法相比更为简单，准确，并充分体现出了UPLC-Q-TOF-MS/MS技术在复杂体系中对未知化合物进行快速鉴定的优势。本实验进一步为血必净药效成分的筛选、定量分析及质量控制提供参考依据，对揭示其药效物质基础具有现实意义。

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