石柱参也称柱参，为人参从野生变种植的优良品种，至今已有40余年的栽培历史^[1]。石柱参原是指产于辽宁省宽甸满族自治县下露河乡（现为振江镇）石柱子村的人参，并由此而得名，民间素有“柱参不到不开行”的说法，在中国栽培人参中占有重要地位。2013年5月21日中国农业部批准“辽宁宽甸柱参传统栽培体系”为“中国重要农业文化遗产”。人参叶为2015版《中国药典》收载品种^[2]，经研究人员发现人参叶的主要成分为皂苷类化合物^[3]，现已分离并确定的单体皂苷已有60多种，人参叶中皂苷类成分具有抗肿瘤、抗衰老、护心护肝、调节免疫，以及促进细胞增殖等多种作用^[4-11]。人参茎叶与人参根的药理作用相似，但是人参茎叶的总皂苷含量明显高于人参根的含量^[12]，且人参叶具有资源丰富、价格低廉、皂苷类有效成分含量高等特点，因此具有广阔的开发前景。由于受阳光、土壤、水分等影响，不同产地人参叶质量存在差异，药材的化学成分含量不尽相同。本实验将研究丹东市宽甸石柱满族自治县和吉林省抚松县两个产地的人参叶，利用指纹图谱比较两者的相似度及分析石柱参的特点，为人参叶资源的合理应用和质量控制提供依据。

1 仪器及试药 1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；万分之一分析天平（Acculab型，Sartorius group）；超声波清洗器（KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52C型，巩义市予华仪器有限公司）。

1.2 试药试剂

色谱乙腈（Simark，韩国）；色谱甲醇（Oceanpakalexative chemical，瑞典）；水为纯净水；磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

人参叶分别采于丹东市宽甸石柱满族自治县、吉林省抚松县，共10批样品，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为（Panaxginseng C. A.Mey.）的叶子。

2 溶液制备 2.1 供试品溶液的制备

取人参叶干燥粉末（过60目筛）0.2 g，精密称定，用滤纸包成茶叶包，放入圆底烧瓶，加石油醚30 mL回流1 h，弃去溶剂，甲醇50 mL，80 ℃回流3 h，将提取液旋干，加甲醇溶解后，转至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、20（S）-人参皂苷Rg2、20（R）-人参皂苷Rg2、F1、Rc、Rb2、Rh1、Rd对照品适量（由本实验室自制），加甲醇制成每l mL含1.0 mg的溶液，即得。

3 高效液相色谱法（HPLC）色谱条件

安捷伦ZORBAX SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，二极管阵列检测器（DAD），以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B梯度洗脱^[13]，流速1.3 mL/min；柱温30 ℃；检测波长203 nm。见表 1。

4 实验结果 4.1 精密度

取人参叶供试品进样20 μL，即得供试品溶液，连续进样6次，以Rd为参照，计算各峰与Rd峰面积比值、相对保留时间的RSD，测得各记录色谱图，结果表明各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，其RSD均小于3%，符合指纹图谱技术要求。

4.2 重复性

分别精密称定人参叶样品6份，按照2.1项下操作，分别进样20 μL，记录色谱图。以Rd为参照，计算各峰与Rd峰面积比值、相对保留时间的RSD，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，其RSD均小于3%，符合指纹图谱技术要求。结果表明，本方法重复性良好。

4.3 稳定性

精密吸取同一供试品溶液20 μL，按照上述色谱条件，分别于0、4、8、12、18、24 h，记录色谱图。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，其RSD均小于3%，结果表明供试品溶液在24 h内成分稳定。

4.4 两个产地人参叶的HPLC指纹图谱中的特征峰及指纹图谱的确立

分别精密吸取供试液各20 μL，注入液相色谱仪，记录120 min色谱图。用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”对数据进行分析，提取共有峰并生成标准图谱。通过与皂苷的标准品对比，人参叶色谱图中确定1为Rg1，2为Re，6为Rb1，7为20（S）-人参皂苷Rg2，8为20（R）-人参皂苷Rg2或F1，9为Rc，10为Rb2，11为Rh1，12为Rd（S）。借助软件对10批供试品的检测结果进行处理，以Rd参照峰，提取面积百分比大于0.35%（峰面积100）的峰作为有效峰组成相应样本。数据和色谱图见图 1、图 2、表 2、表 3。

该实验首次对辽宁石柱县和吉林抚松产地的人参叶进行指纹图谱比较分析，共有22个共有峰，采用HPLC法确定了其中的10个峰。对10批两个产地人参叶样品进行处理分析，样品的HPLC指纹图谱基本一致，各个峰的相对峰面积有差异性，表明不同产地人参药材的质量存在差异性。吉林产地Rb2、Rd含量较高，辽宁产石柱参叶Rg1、Re、Rb1、20(R)-人参皂苷Rg2、Rh1含量多，且辽宁石柱产人参叶比吉林产人参叶多了一个非共有峰（占总峰面积的2%）。

5 讨论

本研究中人参叶的液相条件根据药典中人参根的液相条件经过反复摸索、优化获得。调整人参叶液相条件中的流动相比例和梯度洗脱时间从而使人参叶中各皂苷成分达到很好分离，本实验中选用了1%磷酸水溶液作为流动相B，通过添加改性剂可以有效改善色谱峰峰型。在方法学考察时，精密度实验、重复性实验和稳定性实验中计算各峰与Rd峰面积比值、相对保留时间的RSD，测得各记录色谱图，结果表明各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，其RSD均小于3%，符合中药指纹图谱的要求。采用HPLC法以人参皂苷Rg1、Re、Rb1、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、F1、Rc、Rb2、Rh1、Rd为对照品确定了其中的10个峰，并标定出22个10批两个产地人参叶样品指纹图谱的共有峰，通过与对照指纹图谱比较，得到HPLC指纹图谱的相似度，均大于0.9，相似度较高。

由于人参茎叶与人参根具有相似的药理作用，而且人参叶资源丰富，价格相对便宜，目前以人参叶为原料药材提取人参皂苷应用逐渐增多, 为了更有效地控制其内在质量, 从而保证制剂质量的稳定, 用HPLC建立了石柱和抚松产人参叶指纹图谱分析方法，本研究用10个人参皂苷标准品标定了辽宁石柱参和吉林抚松参，并进一步改进并提高了人参叶药材的质量标准。尤其石柱参是辽宁道地名贵药材，品质优越，在中国栽培人参中占有非常重要的地位，在进行指纹图谱比较分析时发现多种皂苷含量多于吉林产人参叶，而且比吉林产人参叶多了一个非共有峰（占总峰面积的2%），多出的非共有峰，其物质基础尚不清楚，有待进一步研究，非共有峰的存在可能与人参生长环境有关，应给予广泛关注。