动脉粥样硬化（AS）发病率逐年升高，导致受累动脉管腔狭窄，相应脏器如心、脑等缺血乃至梗死，严重威胁到人类健康^[1]。内皮细胞损伤是AS的始动环节；高胆固醇血症是AS的物质基础。胆固醇以脂蛋白，尤其是低密度脂蛋白（LDL）的形式在血液内运输，被氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL）是公认的AS独立危险因素。AS被看作是特殊类型的慢性炎症反应，CD40信号是一个与AS关系密切的炎症信号，激活该信号可促进肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、可溶性血管细胞间黏附分子-1（sVCAM-1）、白介素-1（IL-6）、白介素-8（IL-8）等炎症介质的表达，促进AS发生发展^[2]。ox-LDL被认为是上述炎症过程的关键诱导因子。然而，ox-LDL诱导动脉局部炎症反应与内皮细胞CD40信号的相关性尚未被深入阐明。

传统中药黄芪，性温、味甘，具有补气固表、利尿脱毒、排脓等功效，用于气虚乏力、气虚水肿、气虚自汗、久溃不敛等症。现代药理学研究表明，黄芪具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、抗衰老、抗疲劳等作用。黄芪在传统中医中应用广泛，尤其在心脑血管疾病方面，具有作用靶点多、廉价安全的特点。黄芪皂苷、黄芪多糖和黄芪异黄酮是黄芪主要活性成分。作为黄芪皂苷的活性成分，黄芪甲苷被认为是评价黄芪药材质量优劣的标准和关键有效成分。它具有抗氧化、抗炎、抗血栓等功效，临床用于治疗冠心病、心力衰竭、高血压等心脑血管疾病^[3]。但黄芪甲苷对ox-LDL诱导的内皮细胞CD40信号表达的影响及其机制尚待深入研究。

因此，本研究以ox-LDL诱导的血管内皮细胞为观察对象，基于CD40信号观察黄芪甲苷对炎症介质TNF-α、sVCAM-1、IL-6、IL-8表达的影响，以特异性抗体拮抗CD40效应，再次观察上述炎症介质的变化，从正反两方面阐明CD40信号与ox-LDL诱导炎症介质的相关性及黄芪甲苷的抗炎效应及作用机制。

1 材料与方法 1.1 主要材料

人脐静脉细胞株（ECV-304）购于南京凯基生物技术有限公司，ox-LDL购自广州奕源生物科技有限公司，黄芪甲苷购于中国药品生物制品检定所，细胞培养基DMEM购于Hyclone公司，实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）引物合成于上海生工生物工程有限公司，Trizol试剂盒和Real-time PCR试剂盒购自Takara公司，小鼠抗人β-actin抗体和CD40抗体购于美国Sigma公司，sVCAM-1、TNF-α、IL-6和IL-8酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自武汉博士德公司，拮抗性CD40单克隆抗体购于Invitrogen公司，其余均为市售分析纯。

1.2 细胞培养与处理

ECV-304采用DMEM培养基常规培养、传代，实验选取指数生长期细胞进行。内皮细胞生长至接近80%时，无血清同步化处理12 h后，更换不同培养基：常规培养基（空白对照组）、常规培养基+100 mg/L ox-LDL（ox-LDL组）干预24 h、20 μg/mL的黄芪甲苷预干预4 h+100 mg/L ox-LDL继续干预24 h（黄芪甲苷+ox-LDL组）。

1.3 Real-time PCR检测

按Trizol总RNA提取检测试剂盒说明书提取细胞总RNA。取500 ng总RNA逆转录为cDNA，取1 μL cDNA进行Real-time PCR扩增反应，引物序列如下：β-actin（forawrd）：5’-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’，β-actin（reverse）：5’-CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC-3’，产物长度为108 bp, CD40（forawrd）：5’-TTCGCTTTCACCGC-AAGGA-3’，CD40（reverse）：5’-TGTGCCAGCCAG-GACAGAA-3’, 产物长度为80 bp，反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36个循环。计算2^-△△CT值，比较各组CD40表达的差异。

1.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测

将收集的内皮细胞加入三去污裂解液充分裂解，BCA蛋白定量法测定各组蛋白质含量。经电泳、转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。β-actin（1:2 000）和CD40（1:1 000）相应一抗4 ℃孵育过夜，用辣根过氧化物酶标记的相应二抗孵育2 h，充分洗膜后，显影、拍照保存。应用Quanty One软件分析目的条带与同一泳道内参β-actin的累积光密度比值，作为该泳道中目的蛋白表达的最终结果。

1.5 ELISA分析

干预结束后，收集各组细胞上清液，去残渣，过滤除菌，冻干浓缩5倍，参照sVCAM-1、TNF-α、IL-6和IL-8 ELISA检测试剂盒使用说明书操作，用酶标仪测定各孔A值，比色波长490 nm，根据标准品的A值换算公式，计算各样品待测蛋白的浓度。

1.6 CD40抑制分析

若ox-LDL干预后CD40、sVACM-1、IL-6和IL-8表达均上调，则预先加入抗CD40抗体干预2 h后，再加入100 mg/L的ox-LDL孵育24 h，继续观察内皮细胞可溶性sVCAM-1、TNF-α、IL-6和IL-8蛋白的表达，分析可溶性sVCAM-1、TNF-α、IL-6和IL-8蛋白上调与CD40的相关性。

1.7 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，所有数据均用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 黄芪甲苷对ox-LDL刺激内皮细胞后CD40 mRNA和CD40蛋白比较

100 mg/L ox-LDL刺激内皮细胞24 h后，CD40 mRNA和CD40蛋白表达上调，与空白对照组相比差异有统计学意义（P < 0.01）；20 μg/mL的黄芪甲苷预干预4 h后，明显抑制ox-LDL诱导的CD40 mRNA和CD40蛋白的表达（P < 0.05），见表 1、图 1。

2.2 黄芪甲苷对ox-LDL刺激内皮细胞后TNF-α、sVACM-1、IL-6和IL-8分泌的比较

与空白对照组相比，100 mg/L ox-LDL刺激内皮细胞24h后，其细胞培养上清液中TNF-α、sVACM-1、IL-6和IL-8增多（P < 0.01）；以20 μg/mL的黄芪甲苷干预内皮细胞4 h后，再以100 mg/L ox-LDL刺激24 h，TNF-α、sVACM-1、IL-6和IL-8分泌均减少，与ox-LDL组相比差异有统计学意义（P < 0.05），见表 2。

2.3 拮抗性CD40抗体对ox-LDL刺激内皮细胞后TNF-α、sVACM-1、IL-6和IL-8分泌的影响

与单纯ox-LDL组相比，拮抗性CD40抗体孵育2 h后，100 mg/L ox-LDL刺激内皮细胞后TNF-α、sVACM-1、IL-6和IL-8分泌均减少（P < 0.01），见表 3。

3 讨论

CD40为Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要见于B淋巴细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞等。CD40与其配体相互作用，是淋巴细胞间传递炎症和免疫信号的重要途径。近期研究显示，CD40信号不仅参与感染性疾病的免疫调节，还促进动脉粥样硬化的发生发展^[4]。研究发现，正常成人动脉组织和内皮细胞CD40表达甚微，但在ox-LDL、TNF-α等内、外源性CD40配体（CD40L）刺激下，AS斑块相关细胞，如平滑肌细胞、内皮细胞CD40表达明显上调^[5-6]，与本研究ox-LDL刺激内皮细胞后CD40基因和蛋白表达上调的结果相一致。

局部炎症反应在AS发生、发展中发挥了关键作用。CD40被看作是心血管系统的炎症标记物^[7]，与其配体结合可产生一系列免疫炎性反应，诱导内皮细胞前炎因子和趋化因子，如TNF-α、sVACM-1、IL-6和IL-8等产生^[8-9]。上述细胞因子可促进内皮细胞与淋巴细胞、单核细胞等黏附并诱导其活化，维持和加剧受累动脉局部炎症反应，增加内皮细胞的损害程度^[10-11]。受损内皮细胞又进一步促进胆固醇在动脉壁的聚集和功能失调，形成恶性循环。研究显示CD40与TNF-α、sVACM-1、IL-6及IL-8等可相互促进，而本研究给予拮抗性CD40抗体预干预后，TNF-α、sVACM-1、IL-6及IL-8分泌明显减少，提示ox-LDL刺激内皮细胞上述前炎因子和趋化因子的表达主要通过CD40信号所介导。因此，有效抑制CD40信号可抑制动脉内皮局部炎症反应，发挥抗AS作用^[12]。

中药单体黄芪甲苷是一种羊毛脂醇形的四环三萜皂苷，分子式为C₁₄H₆₈O₁₄，已被广泛用于抗AS^[13]。本实验发现黄芪甲苷能够有效下调ox-LDL刺激的内皮细胞CD40 mRNA和蛋白的表达，提示黄芪甲苷对ox-LDL所致内皮细胞CD40信号具有潜在的抑制作用^[14]。在此基础上，本实验进一步观察了内皮细胞上清液中CD40信号下游因子TNF-α、sVACM-1、IL-6、IL-8等的含量，数据显示黄芪甲苷可有效抑制上述因子分泌，显示了黄芪甲苷具有良好的抗炎特性。总之，黄芪甲苷具有良好的抗AS作用，其作用机制可能与下调内皮细胞CD40信号及其下游黏附分子和炎症介质表达有关。