应用磁场治疗疾病是中医学的重要组成部分^[1-3]，至今仍在临床上体现着独特的医疗应用价值^[4-7]。本研究运用现代技术手段对经过磁场作用后的活血通络灵液，即磁化活血通络灵液的作用效果进行实验研究，为更好地掌握活血通络灵液的使用提供基础实验依据。

1 实验材料 1.1 实验动物

SD雌性大鼠120只（3月龄），体质量（220±10）g，SPF级。由北京维通利华实验动物中心提供。实验大鼠在SPF级动物室中饲养，温度（22 ±2）℃，湿度（50±10）%，换气次数每小时不小于14次，人工照明12 h，每笼饲养12只，每周换2次笼具。饲料经钴60灭菌，大鼠每日每只喂食20 g，饮用高压灭菌水。

1.2 试剂

磁化活通灵液方剂组成：蜈蚣、地龙、三七、杜仲、乌梢蛇等中药药材为主。具体制作要求：取上述药材等量，每千克加入65%的白酒1.5 kg，置于玻璃器皿内，在容器特定位置放置钕铁硼磁片，磁化50 d后封存备；阿仑膦酸钠片（福善美）70 mg，购自杭州默沙东制药有限公司（批号08113，国药准字J20040004，进口药品注册证号H20030488）。

1.3 检测仪器

临床前小动物Inveon PET·SPECT·CT（德国SIEMENS公司）；E400CS/AW-硬组织磨片机（德国EXAKT公司）；E310CP-硬组织切片机（德国EXAKT公司）；Jung K重型切骨机（德国Jung公司）；3230型-万能力学试验机（美国BOSE公司）；DW-双能X线骨密度仪（美国HOLOGIC公司）；TIU-全电动正置显微镜（日本Nikon公司）；TIU-倒置研究型荧光显微镜（日本Nikon公司）；M4 -多功能酶标仪（美国MD公司）；15R-冷冻离心机（美国Beckman公司）；静磁场柔性磁条:强度分别为120 mT、180 mT、220 mT（由浙江和也健康科技有限公司提供）。

2 实验方法 2.1 造模方法

采用SD雌性大鼠120只，3个月龄，体质量（220±10）g。购进后先饲养1周，观察无异后，备用。在1.5%复方氯胺酮0.5 mL/kg腹腔内麻醉下，手术切除卵巢。摘除方法：皮肤无菌消毒，背部、脊柱旁切口，依次切除双侧卵巢、结扎输卵管和伴行血管。冲洗，手术切口缝合。术后观察3 d，确认无异常后采用随机数字表法分为7个实验组^[8]，每组12只。去势对照组：去势术后不再做任何干预。去势后服用阿仑膦酸钠组（阳性药物对照组）：术后3 d，以蒸馏水稀释，鼻饲法，早9时每周1次，服用阿仑膦酸钠7 mg/（kg·w），连续服药直至处死。磁化活血通络灵药液组：术后3 d，大鼠涂抹磁化活血通络灵药于腹部正中，10 mL/（kg·d），每次涂抹面积5 cm×5 cm，每日2次，每日早9时、下午3时，直至处死。加磁1组（120 mT）、加磁2组（180 mT）、加磁3组（220 mT），各加磁组持续加磁，直至处死。空白对照组：未加任何干预的正常大鼠。

2.2 检测方法及指标

术后5周，行第1次心脏取血。每组取血6~8只，用于骨代谢指标检测。术后6周，各实验组分取6只大鼠处死，行骨组织形态计量学研究。术后18周，按前法行第2次心脏取血，同前法检测。各组实验大鼠处死，分取双下肢股骨，用于骨密度、Micro-CT、骨生物力学检测。

2.2.1 骨组织形态计量学 2.2.1.1 骨组织切片制备

取实验大鼠左侧股骨下1/3骨组织，固定，逐级脱水，浸入3:7比例的甲基丙烯酸丁/甲酯溶液中24 h，包埋于半聚合态甲基丙烯酸丁/甲酯中。标本聚合后，用Jung K重型切骨机连续切7 μm不脱钙切片5张，分别行von Kossa及Gimsa染色，在光镜和倒置荧光显微镜下观察与测量。

2.2.1.2 骨组织形态计量学观察

1）测定区域划分：各组切片均选骺板下1 mm内骨小梁，分内、中、外3点选取图像录入微机。每个标本采用3种观察方法：Gemisa染色用于组织学观察；von Kossa染色用于类骨质观察；四环素标记观察选用倒置荧光显微镜。采用Nikon-TIU全电动正置显微镜图像处理分析系统对11个骨组织形态计量学参数测定。2）骨组织形态计量学参数包括：平均骨体积（TBV）、骨再建单位时间（δ）、类骨质表面（TOS）、平均类骨质宽度(MOSW)、成骨细胞表面（TBOS）、四环素单标记表面（STS）、单双标记表面比（STS/DTS）、骨矿化沉积率（MAR）、纠正骨矿化沉积率（iMAR）、骨矿化延迟时间（MLT）。

2.2.2 骨密度测定

实验大鼠处死后，取出左侧股骨，剔除骨骼表面附着的软组织，放入生理盐水小瓶中，-20 ℃低温冰箱保存。测定前1 d，移至4 ℃冰箱。选用DW-双能X线骨密度仪测定前，选用标准模块自检，校正仪器精密度。参数指标为Est.Area（cm²）、Est.BMC（mg）、BMD（mg/cm²）。测定单位：大鼠股骨扫描区域每平方厘米所含骨矿物质的量，以mg/cm²表示。

2.2.3 特异性小梁骨分析

Micro-CT扫描检测基本上包含采集、重建、分析3个步骤。运用临床前小动物PET·SPETCT·CT进行特异性小梁骨分析，主要过程为：1）选自骨密度测定后左侧股骨。首先确定标本扫描所需的分辨率，将标本固定在扫描板上，开启舱门，将扫描板安置在扫描床上，以激光初确定扫描部位，后关闭舱门。2）应用采集软件IAW，采集标本二维图像；选择相应分辨率之后，在放射透视下以Scout View程序对扫描部位准确定位，开始扫描。扫描完成后，建立新的Workflow，对所采集的数据进行重建。3）应用分析软件IRW将重建后数据导入，进行标本二维、三维截图，分析骨及小梁骨相关数据。选取的参数指标有：骨容量/组织容量、骨表面/容积、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间隙及骨小梁模式因子等参数。

2.2.4 骨生物力学测定

选用3230型-万能力学试验机对标本进行三点弯曲试验。实验前，取冰箱冻存的实验大鼠右侧股骨，置入PBS缓冲液中室温下复温，将股骨放在试验机支架上（跨距=20 mm），以0.5 mm/s的速度加压股骨中段，直至股骨断裂，记录载荷-形变数据，记录参数为：最大载荷、最大挠度、最大应力及股骨断端横截面尺侧最大直径。

2.3 数据的统计学处理

所有实验数据均采用SSPS 17.0统计软件进行分析，实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 骨组织形态计量学检测结果

本实验骨形态计量学共检测11项指标，发现与去势组比较在骨重建、矿化时间、J矿化率及矿化率4种重要检测指标上，中药组、磁1、磁2、磁3和阳性药物组均有统计学意义（P＜0.05），在类骨质宽、单双比及单标表面检测指标上，阳性药物和中药组有统计学意义（P＜0.05），余指标与去势组比较显著性差异有所不同。见表 1。

3.2 骨生物力学三点弯曲试验检测结果

本实验骨生物力学三点弯曲试验共检测4项指标，发现与去势组比较只有中药组的最大载荷有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

3.3 Micro-CT检测结果

本实验Micro-CT共检测6项指标，发现与去势组比较在骨容量/总容量、骨表区域/骨容量、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间隙及骨小梁模式因子的6种检测指标上磁1组和阳性药物组有统计学意义（P＜0.05），余指标与去势组比较差异无统计学意义。见表 3。

3.4 骨密度检测结果

本实验双能X测量法测定骨密度，以骨密度作为主要评估指标，发现与去势组比较只有阳性药组有统计学意义（P＜0.05），余指标与去势组比较差异不显著，但中药组的X值优于去势组和磁1、磁2、磁3实验组。见表 4。

4 讨论

骨质疏松症的病因学与发病机制很复杂，精确的发病机制至今尚不清楚。它是由多细胞、多细胞因子、多基因共同参与的网络调节的结果，是以骨量减少为特征的一种全身性骨骼疾病。目前认为激素水平与调控、个体营养状况、免疫功能、物理学因素及遗传因素是促其发病的最重要环节。本项目研究以大鼠摘除卵巢性骨质疏松实验动物模型为研究对象，采用磁化活血通络灵液进行干预性治疗，观察大鼠去势后对骨丢失加快期的积极防治作用。探究这种磁场和中药叠加模式干预或治疗能否延缓骨量丢失，能否延缓骨质疏松症发生的渐进过程。中药实验组选用磁化活血通络灵液作为基础用药与各实验组进行平行对照观察。

磁化活血通络灵液系天津市非物质文化遗产，传统磁石疗法载体，具有百年传承，历经半个世纪，进行临床、科研实验，本项目通过磁化活血通络灵液，以古人“磁石养肾脏、强筋骨、通关节”的理论为基础，运用现代国际前沿水平的多学科的研究方法，探讨磁化活血通络灵液对去势大鼠快速骨流失的影响，以进一步就磁石疗法对去势大鼠形成骨流失的影响进行探讨与研究。

为了更好地反映大鼠去势后骨微细结构的变化，客观地评估磁化活血通络灵液对骨量丢失的影响，通过查阅文献，参考同行意见^[9-12]，选用双能X吸收测量法、骨形态计量学方法、临床前小动物Micro-CT以及骨力学三点弯曲试验，进行平行对照比较，从多视角获取数据，相互验证。

Micro-CT能够对小梁骨进行特异性分析，可以客观真实地提供每单位体积骨量的测定值，可信度高。骨小梁模式因子反映骨小梁凸面和凹面的程度及骨小梁连接性，数值越小骨小梁连接性越好，本实验中药组数值低，提示对防止骨小梁断裂有益。

实验发现中药组的χ²值优于去势组和磁1、磁2、磁3实验组。这一结果很重要，因各实验组未给予任何抗骨质疏松药物，骨量增加很困难。实验结果表明，去势大鼠经磁化活血通络灵液治疗后，BMD检测骨量增加，这很可能是对损伤微环境的改善，对于维系骨细微结构的完整性以及延缓松质骨丢失的速度有益。在以往大量的前瞻性和回顾性研究均发现BMD值与骨折发生率密切正相关，可为预测骨折危险性提供依据^[13-15]。该药对于维系骨细微结构完整性的有益作用很重要，并在骨力学三点弯曲试验中得到验证。骨组织形态计量学能够准确地测量骨矿化的动态指标，能够较客观地记录经过治疗后骨组织的变化。

去势大鼠术后12周，去势组组织学观察出现明显的骨质疏松表现，骨计量学结果显示，去势组与中药组比较，骨计量静态指标骨体积、类骨质表面、平均类骨质宽度差异有统计学意义。骨计量学指标分析显示，去势后骨体积密度显著性下降，经磁化活血通络灵液治疗得到改善，还发现去势组与中药组比较，骨的四环素标记率，类骨质表面密度、平均类骨质表面厚度及动态指标中的骨矿化沉积率与骨矿化延迟时间等均有统计学意义。提示去势后骨重建出现明显加快、骨吸收率增加，亦显示该中药可能对抑制破骨细胞性骨吸收有作用。实验表明，去势大鼠经磁化活血通络灵液治疗后，对改善骨细微结构的作用明显。

骨质疏松症的发病基础十分复杂，因此评价基础研究与判定药物疗效时，不仅要考量骨密度、骨形态计量学以及Micro-CT测量的参数，还要考量骨折发生实际的测量参数，这样才能更为客观而准确地反映骨强度的变化。基于这种理念与思考，本实验设计选择力学三点弯曲试验作为验证，为今后的临床实践提供参考依据。

有关磁疗研究曾经在上个世纪末出现过一段热潮，然而受限于理论与技术条件，实际能够提供理论和实验支持并不多见。相关文献^[16-18]中提出，磁化可能改变了液态水的结构，影响它的性质；水中的杂质可能在磁化过程中储能，可能是磁化水效应的重要原因之一；水经过磁化处理后，使得小的水分子更容易进入蛋白质内部，更加活化了蛋白质结构，使蛋白质内部结构更加趋于整体化。所以磁化水的研究可能为磁化活血通络灵液的机理提供一种解答思路；根据已有的磁源定量研究^[19-20]，可以实现磁场强度与药液性状改变的量效学分析。

百年传承磁化活血通络灵液形成古方药剂，已成为独有的卫生资源，如何挖掘整理，去陈创新，是当下面临的重要课题。下一步，运用现代医学科学理论与技术方法为基础，以现代药学法典、法规为标准，解决好古方药剂的药品质控、药理、药化及方解问题。