银杏叶是一种常用中药，具有促进血液循环，抗氧化及抗血凝的作用^[1]。化学成为主要含有黄酮类成分、萜内酯类、酚类、氨基酸、维生素、亚油酸、奎宁酸等化合物^[2]。舒血宁注射液是银杏叶提取物经灭菌加工制成的水溶液^[3]，临床多用于冠心病、心绞痛、脑血管痉挛等心脑血管疾病的治疗^[4]。现代医学研究表明舒血宁注射液能够改善血液流变学，抑制血小板聚集，对于急性脑梗死也具有一定治疗作用^[5]。氨基酸作为必需营养成分之一，不仅是生物代谢过程中的重要物质，也是组成酶的重要物质^[6]。近年来，随着人们对舒血宁注射液的药效物质认识深入，对其质量的研究也越来越受到关注。有学者测定了舒血宁注射液中原型黄酮醇苷、银杏总黄酮苷、5-羟甲基糠醛的含量^[7-9]，然而有关舒血宁注射液中氨基酸的含量还未见报道。

测定氨基酸的方法有氨基酸自动分析仪，衍生高效液相色谱法、光谱分析法、毛细管电泳分析法、色谱分析法等^[10]。氨基酸分析仪分析时间长，设备要求专用，具有一定的局限性^[11]。衍生高效液相色谱法，包括柱前、在柱、柱后衍生高效液相检测法。由于在柱衍生必须配备搅拌装置，柱后衍生又存在反应室死体积小, 反应速率要快的缺点，现主要采用柱前衍生高效液相色谱法分析氨基酸^[12]。其优点是灵敏度高，检测限低和操作简便，使得该方法在氨基酸分析方面广泛使用^[13]。氨基酸的柱前衍生化试剂主要有异硫氰酸苯酯、邻苯二甲醛、丹磺酰氯等^[14-17]。在氨基酸衍生化试剂中，异硫氰酸苯与氨基酸反应后，产物稳定，具有紫外吸收，是氨基酸常用的柱前衍生试剂^[17]。

本文采用异硫氰酸苯酯柱前衍生法对舒血宁注射液中的天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸进行定性定量，为舒血宁注射液的质量评价提供一定的依据。

1 材料与试药 1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱系统（型号：F04BLS145C）；waters 2487检测器（型号：C04BLS014C）；万分之一天平（德国赛托利斯公司）；离心机（德国Sigma公司）；超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO）。

1.2 试药

天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸对照品均购自于中国食品药品检定所；醋酸钠（天津市风船化学试剂科技有限公司）；三乙胺（天津市光复精细化工研究所）；甲醇、乙腈为色谱纯（天津市康科德科技有限公司）；实验用水为Milli-Q超纯水（Millipore公司，Mill-QⅡ型）；其余试剂均为分析纯；30批舒血宁注射液为河北神威药业股份有限公司提供。

1.3 色谱条件

Accurasil C₁₈柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（5：1）(A）-pH 6.5的乙酸铵（0.10 mol/L）水溶液（B），梯度洗脱；流速为1 mL/min；温度：35 ℃；进样量：5 μL。梯度洗脱程序如下：0~5 min，6%A；5~6 min，6%~10%A；6~8min，10%~13%A；8~11 min，13%A；11~13 min，13%~13.5%A；13~20 min，13.5%~28%A；20~25 min，28%~30%A；25~35 min，30%~36%A；35~40 min，36%~100%A。

1.4 衍生剂的制备

异硫氰酸苯酯（PITC）衍生化试剂的配置方法：精密量取PITC 0.6 mL置于50 mL容量瓶中，加乙腈混匀，定容，即得。三乙胺（TEA）溶液的配置方法：精密量取TEA 7 mL置于50 mL容量瓶中，加入乙腈混匀，定容，即得。

1.5 对照品储备液的制备

精密称取天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸对照品，加0.1 mol/L的盐酸配成对照品储备液，依次稀释至不同的浓度，分别取不同浓度的对照品溶液200 μL，加入600 μL的PITC，600 μL的TEA，超声衍生60 min，正己烷萃取，取下层溶液14 000 r/min离心10 min。置4℃冰箱中保存备用。

1.6 样品溶液的制备

精密量取200 μL舒血宁注射液，加入600 μL的PITC，混匀后，加入600 μL的TEA，混匀，超声衍生60 min，取溶液，用正己烷萃取，取下层溶液，离心，取上清液，作为样品溶液。

2 结果 2.1 方法学验证 2.1.1 标准曲线、线性范围、检验限（LOD）和定量限（LOQ）

将上述对照品按照确定的色谱条件分别进样，记录峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸标准曲线的回归方程、线性范围、LOD和LOQ见表 1。

2.1.2 精密度

吸取200 μL舒血宁注射液，加入600 μL的PITC，混匀，再加入600 μL的TEA，混匀，超声60 min，取溶液，用正己烷萃取，取下层溶液，离心，得上清液，按色谱条件进样5 μL，连续进样6次。结果峰面积RSD分别为1.51%、2.83%、2.01%、2.01%。实验结果表明所建立的方法精密度良好。

2.1.3 重复性

吸取200 μL舒血宁注射液，加入600 μL的PITC，混匀，再加入600 μL的TEA，混匀，超声60 min，取溶液，用正己烷萃取，取下层溶液，离心，得上清液，按色谱条件进样5 μL，连续进样6次。重现性RSD实验结果分别为0.75%、2.55%、1.49%和2.18%。实验结果表明测定方法重现性良好。

2.1.4 稳定性

取同一样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h后进样5 μL，测定天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸的峰面积。结果峰面积RSD分别为1.99%、3.47%、2.37%、2.75%。可见样品在24 h内稳定性良好。

2.1.5 加样回收率

取舒血宁注射液100 μL，加入100 μL的对照品溶液，加入600 μL的PITC衍生，600 μL的TEA扫尾，超声提取60 min，正己烷萃取，取下层溶液离心，平行6次，按色谱条件进样5 μL。另取样品200 μL，加入600 μL的PITC衍生，600 μL的TEA扫尾，室温下超声提取60 min，正己烷萃取，取下层溶液离心，平行6次，按色谱条件进样5 μL。

按公式：（测得量-样品中的含量）/加入量=回收率，计算加样回收率，见表 2。

2.2 样品测定

按照上述色谱条件进样，测得峰面积，计算天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸的含量。色谱图见图 1，样品测定结果见表 3。

3 讨论

本研究分别考察了流动相组成[乙腈-水，乙腈-水（5：1）-乙酸钠缓冲溶液（pH 6.5）]对4种氨基酸色谱分离的影响，研究结果表明采用梯度洗脱方式，以乙腈-水（5：1）-乙酸钠缓冲溶液（pH 6.5）为流动相，4种氨基酸分离效果较好，且峰形较佳。本研究最终确定了乙腈-水（5：1）-乙酸钠缓冲溶液为分离舒血宁注射液中氨基酸的最佳流动相。

由于氨基酸没有紫外吸收，不能用紫外直接检测，需要衍生后在紫外下才可检测。异硫氰酸苯酯是常用氨基酸测定的衍生试剂, 与氨基酸衍生化反应迅速，所得产物稳定，同时柱前衍生高效液相色谱法具有分析时间短，选择性强，节约成本等特点。因此，本文采用PITC柱前衍生高效液相色谱检测方法，对舒血宁注射液中的4种氨基酸进行定量分析，结果表明这种方法稳定、准确、快速，能够准确测定舒血宁注射液中的4种氨基酸含量。

通过对舒血宁注射液中的氨基酸进行检测，4种氨基酸的总含量为1 738.47 μg/mL。其中，甲硫氨酸含量最高，其原因可能与甲硫氨酸是舒血宁注射液的辅料有关。丙氨酸的含量较低，在0.03~5.31 μg/mL范围内，含量波动较大。30批舒血宁注射液各批次间4种氨基酸总含量方差分析结果表明，各批次间4种氨基酸的总含量几乎没有显著的差异（P > 0.05）。本文建立了同时测定舒血宁注射液天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸4种氨基酸柱前衍生高效液相色谱方法，为舒血宁注射液中氨基酸的含量测定提供了技术支撑。

4 结论

本文建立了PITC柱前衍生同时分离并测定了舒血宁注射液中4种游离氨基酸的分析方法，具有操作简便，准确快速的特点，可用于舒血宁注射液中氨基酸的质量控制。