在中医经典中，虽然没有青光眼这一概念，但有关本病临床证候的记载，在阐述眼和头部的关系时，却有很多与之相吻合。《灵枢·大惑论》云:“五脏六腑之精气，皆上注于目而为精。精之案为眼……上属于脑，后出于项中。故邪中于项，因逢其身之虚，其入深，则随眼系以入于脑，入于脑则脑转，脑转则引目系急，目系急则目眩以转矣。”青光眼是一种具有病理性高眼压或正常眼压合并视乳头、视网膜神经纤维层损害及青光眼性视野改变的可以致盲的眼病，中医称为“五风内障”。其是导致人类失明的三大致盲眼病之一，它引起的视功能损伤是不可逆的，后果极为严重，如不及时治疗，视野可以极度缩小直至失明^[1]。谷氨酸（Glu）是一种重要的神经兴奋性氨基酸，是视网膜神经突触的主要传导递质，主要存在于神经末梢的囊泡内，通过谷氨酸-谷氨酰胺循环保持着稳定的浓度，主要通过兴奋性氨基酸载体吸收进入MUller细胞进行转运^[2]。已有研究证明视网膜缺血-再灌注和青光眼模型视网膜内存在高浓度的谷氨酸，并引起神经节细胞的损害，足够的证据表明谷氨酸与介导视网膜神经细胞死亡有密切关系^[3]。大多数青光眼患者单用一种药物降眼压效果不理想，需要联合用药。联合用药可以增强降眼压的效果并且可以减少单用一种药物的毒副作用^[4]。

葛根素（PUE）是中药葛根的有效成分，临床用于治疗各种眼部疾病，降眼压，视网膜动静脉阻塞等^[5-6]；灯盏乙素（SCU）是灯盏花素的有效成分，大量研究表明其可以改善微循环，降低血脂，抑制血小板凝集等作用。两种药物在眼科方面具有扩张血管，增加局部供血，促进视网膜上渗出物吸收，保护视网膜色素细胞及视神经的作用^[7-8]。但两者联合用药至今未见报道。因此本实验将葛根素和灯盏乙素同时包封于阳离子纳米粒体系中，使得葛根素率先降低眼压，灯盏乙素改善微循环，从而达到标本兼治，治疗青光眼的作用。本实验建立了测定葛根素和灯盏乙素阳离子脂质纳米粒和药物溶液对青光眼家兔玻璃体内游离谷氨酸盐浓度变化的高效液相色谱-荧光检测法（HPLC）。

1 材料 1.1 动物

健康成年雄性家兔30只，体质量2.5~3.0 kg，购于天津中医药大学实验动物中心提供。

1.2 材料与试剂

水合氯醛（天津市化学制剂六厂）；氧氟沙星滴眼液（天津市江田化工技术有限公司）；葛根素（PUE，纯度：> 99%，南京泽朗医药科技有限公司）；灯盏乙素（SCU，纯度：> 98%，南京泽朗医药科技有限公司）；卵磷脂（上海蓝季生物有限公司），胆固醇（上海蓝季生物有限公司）；十八烷基羧甲基壳聚糖季铵盐（QACMC，江苏南通绿神生物工程有限公司）；同心圆探针（瑞典CMA公司）。

1.3 仪器

CMA 402微渗析泵（瑞典CMA公司）；Agilent-1260高效液相荧光检测器（美国安捷伦公司）。

2 方法与结果 2.1 溶液的配制

邻苯二甲醛（OPA）衍生化溶液配制：称取10.0 mg的OPA在250 μL甲醇中溶解，加入20 μL巯基乙醇，再用pH 9.5的硼酸缓冲溶液稀释至2.0 mL，备用。磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.24 g，磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）1.44 g，氯化钠（NaCl）8.0 g，氯化钾（KCl）0.2 g，并加入1 L蒸馏水，搅拌使充分溶解，用稀盐酸调节pH，作为等渗溶液。

2.2 阳离子脂质纳米粒（CLN）制备方法

精密称取葛根素、灯盏乙素、GMO、F127、卵磷脂、胆固醇、QACMC适量，将灯盏乙素和GMO加入无水乙醇溶解作为油相，于水浴下将油相滴加到水相中；再将卵磷脂和胆固醇用甲醇和乙醇溶解作为油相，葛根素和F127为水相加入PBS 6.7溶解，于水浴下将油相滴加到水相中，磁力搅拌，再将灯盏乙素滴加进葛根素中，即得葛根素和灯盏乙素阳离子脂质纳米粒。

2.3 样品处理方法

移取200 μL玻璃体透析液于l mL离心管中，然后加入100 μL OPA衍生化溶液，混合均匀，反应2 min，取20 μL反应液进样，进行色谱分析。

2.4 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C₁₈（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：50 mmol磷酸盐缓冲液-甲醇（25:75），流速：l mL/min，柱温：30 ℃。检测器：荧光检测器，激发波长（λex）350 nm，发射波长（λem）450 nm。

2.5 线性关系考察

称取定量谷氨酸标准品，用50%的甲醇溶解稀释后即得对照品溶液，用生理盐水配制成浓度分别为5.00、2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 μg/mL的一系列对照品溶液。取以上7个不同浓度的标准溶液20 μL，按照上述确定的色谱条件进样，记录色谱峰面积。以谷氨酸对照品的浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标，绘得标准曲线，求得直线回归方程为A=975.46C-1.630（r=0.999 5），其中A为吸光度，C为溶液浓度，可见在0.078~5.00 μg/mL范围内方程的线性关系良好。

2.6 微透析探针植入

采用0.3%复方卡波姆溶液制备青光眼高眼压模型，眼压升高＞2.93 kPa，并能持续7 d或7 d以上认为构建青光眼动物模型成功^[9]。取青光眼家兔3只，手术前连续给予氧氟沙星眼药水2~3 d，每日2次，可预防手术引发的局部炎症。手术前0.5 h和4 h后，耳缘静脉注射100 U/kg肝素钠，用以防止实验动物前房内纤维化。耳缘静脉注射10%水合氯醛（2.5 mL/kg）行全身麻醉后将其头部固定，用开睑器撑开眼睑并修剪睫毛，开始手术。在角巩膜缘后约2.5 mm处插一小孔，然后把探针插到玻璃体腔内，并将探针的出入口管固定到眼角或者眼周皮层上。术后给予氧氟沙星滴眼液防止感染。经过24 h恢复期和消炎药水的洗净期后，开始药效学实验。

2.7 在体回收率

以生理盐水作为灌注液，3 μL/min冲洗探针1 h，以减轻由于探针植入而引起的眼部充血、炎症等症状。冲洗后依次用0.625、1.25、1.75、2.50、3.35 μg/mL的谷氨酸生理盐水溶液为灌注液进行灌注，流速设定为3 μL/min。更换灌注液时，在收集下一个样品之前，冲洗探针大约0.5 h。所有收集样品直接进行HPLC测定。图 1给出了在体回收率的测定结果，可见C_d-C_p与C_p之间呈良好的线性关系，经回归得到直线方程C_d-C_p=-0.336C_p+0.235（r=0.970 6），回收率为33.60%。

2.8 眼内玻璃体谷氨酸盐浓度的测定

以生理盐水为灌注液，微透析泵流速设为3.0 μL/min，冲洗0.5 h后，分别滴入100 μL阳离子脂质纳米粒和相同浓度的药物溶液，于不同时间点收集眼内玻璃体透析液，采用OPA柱前衍生化法测定玻璃体游离谷氨酸盐浓度，并观察玻璃体中游离谷氨酸盐的浓度变化。表 1和表 2为高眼压家兔分别给溶液组和阳离子脂质纳米粒后的玻璃体游离谷氨酸浓度测定结果。

青光眼家兔局部给药后，收集液采用OPA柱前衍生化法进行谷氨酸盐浓度的变化测定。结果表明，药物溶液的浓度在220 min达到峰值，眼压值最高；而制剂的浓度为140 min，通过对青光眼模型兔进行眼内玻璃体游离谷氨酸盐浓度变化的测定，从表 1、表 2中可看出给药1 h后阳离子脂质纳米粒组可降低兴奋性氨基酸（EAA）的增长，从而减弱视神经损伤。阳离子脂质纳米粒组与溶液组比较玻璃体游离谷氨酸盐浓度降低1.59倍，有统计学差异（P＜0.05）。

3 讨论

采用高效液相荧光检测器进行全波长扫描，分析谷氨酸的最大检测波长，结果表明，激发波长(λex)为350 nm，发射波长(λem)为450 nm时，谷氨酸有较强吸收，且分离效果好。综合考虑检测时各色谱峰的响应和干扰因素，最终选择激发波长(λex) 350 nm，发射波长（λem）450 nm为本实验的检测波长。测定谷氨酸含量的过程中，衍生化后的检测方法通常可选择荧光法或紫外法^[10-12]。荧光检测器灵敏度高，检测限低，适用于微量乃至痕量样品的检测^[13]。本研究采用荧光检测法测定眼内游离谷氨酸的浓度结果较为理想。此外，由于衍生化试剂反应不充分造成谷氨酸盐浓度相对偏差大。

中医对青光眼的处理掌握了内科的整体治疗，运用望闻问切的四诊方法寻找诊疗关键，统一矛盾，其中强调收敛瞳孔的重要性，亦强调了随症见治与灵活应用的重要意义。青光眼主要证型为肝郁气滞、肝肾两亏、阴虚火旺等，证型结果显示本病主要与肝脏有关，其次是脾胃^[1]。谷氨酸作为中枢神经系统的关键兴奋性神经递质，参与到神经信号的传递过程中来，可过量的谷氨酸也会使得神经细胞的兴奋性受到损伤。病理状况下，细胞外间质中的谷氨酸浓度上升时，会过度刺激其受体，使其对神经细胞产生显著的毒性作用^[14]。已经有研究发现高眼压模型视网膜中谷氨酸水平升高，证实谷氨酸参与了高眼压青光眼对其视网膜的损伤，因此认为神经细胞的兴奋性毒性或许对慢性和急性青光眼的视神经损害机制的影响很关键^[15]。此外还有研究发现，青光眼患者眼内视网膜中存在异常氨基酸的释放，其中最主要的便是谷氨酸^[16]，因此如何有效淸除谷氨酸对神经节细胞的兴奋性损伤，是青光眼视神经保护的新方向。

5 结论

采用HPLC法测定眼内游离谷氨酸盐浓度，具有操作简便易行、准确度高、重现性好等优点，为家兔青光眼模型中眼内玻璃体游离谷氨酸盐浓度的测定奠定了基础。