四物汤为经典名方，由熟地黄、当归、白芍和川芎组成，具补血、调血之效，主治营血虚滞证^[1]。中药合煎与单煎是否存在差异以及这种差异对中药临床疗效的影响一直是研究争论的焦点^[2-6]。关于四物汤合煎与单煎的化学成分变化研究已有一些报道^[7-11]，然而同时考察其活性成分芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ在合煎与单煎液中的溶出变化未曾报道。本实验选用四物汤及单味药中主要功效成分芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ进行高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法含量测定，比较这4种成分在单合煎条件下溶出量的变化特点，为四物汤的配伍研究、临床应用和开发利用提供数据支撑和参考依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

2695型高效液相色谱仪（美国沃世特公司），AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），GL-21M湘仪高速冷冻离心机（湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司），SB-5200D型数控超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），ZDHW型调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 试药

中药饮片熟地黄、当归、白芍、川芎均由天津同仁堂有限公司提供，批号分别为熟地黄：1407003，1407007，1407009；当归：1404001，1404007，1404010，白芍：1405001，1405002，1405009，川芎：1405007，1405008，1405010。经天津中医药大学中药鉴定教研室李天祥教授鉴定，熟地黄为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）的新鲜或干燥块根的炮制加工品；当归为伞形科植物当归[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根；白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根；川芎为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎。对照品芍药苷、阿魏酸（中国食品药品检定研究院，批号分别为：110736-201539，110773-201313），对照品藁本内酯（上海源叶生物科技有限公司，批号7B14185），对照品洋川芎内酯Ⅰ（成都曼斯特生物科技有限公司，批号16053115）。试剂甲醇、甲酸均为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱为Cosmosil C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.3%甲酸溶液（B），梯度洗脱顺序为0~5 min，8%~15%A；5~25 min，15%~30%A；25~45 min，30%~50%A；45~60 min，50%~100%A；流速1 mL/min；检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样体积20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品适量，置于5 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得每1 mL含芍药苷3.10 mg的对照品溶液。分别取阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ对照品适量，精密称定，置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，分别制得每1 mL含阿魏酸241.60 μg、藁本内酯240.00 μg、洋川芎内酯Ⅰ 320.00 μg的对照品溶液。

2.3 混合对照品溶液的制备

精密量取2.2项下制备的芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ对照品溶液各1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.4 样品溶液的制备 2.4.1 合煎液的制备

通过对四物汤提取工艺进行正交考察，优选出四物汤合煎液制备方法，按四物汤处方（熟地黄、当归、白芍、川芎=1:1:1:1）称取单味中药饮片各9 g，置于圆底烧瓶中，加入10倍量纯水，回流提取2次，每次2.5 h，滤过，合并2次滤液，冷却后定容至800 mL，备用。

2.4.2 单煎液的制备

称取单味药材熟地黄、当归、白芍、川芎各9 g，按照2.4.1项下方法分别制备各单味药材的单煎液，备用。

2.4.3 阴性样品的制备

按2.4.1项下回流提取方法分别制备缺当归、川芎，缺白芍的阴性样品溶液，备用。

2.5 供试品溶液的制备

精密量取上述方法制备的四物汤合煎液，单味药材单煎液及阴性样品溶液各4 mL，精密加入6 mL甲醇，超声处理30 min，取出，放冷，离心，取上清液置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，摇匀，即得^[12]。

2.6 方法学验证 2.6.1 专属性实验

将2.5项下方法制备的各阴性样品，按照2.1项下的色谱条件，分别进样。结果显示，相应阴性对照在芍药苷、阿魏酸、藁本内酯和洋川芎内酯Ⅰ色谱峰处无吸收峰，显示在该条件下，水提液中其他成分对测定的4种化学成分均无干扰，表明该方法的专属性良好。见图 1。

2.6.2 线性考察

精密吸取2.3项下制备的混合对照液，将其按比例稀释，得混合对照品系列浓度溶液，其中含芍药苷系列浓度分别为19.38、38.75、77.50、155.00、310.00 μg/mL；阿魏酸的系列浓度分别为1.51、3.02、6.04、12.08、24.16 μg/mL；藁本内酯的系列浓度分别为1.50、3.00、6.00、12.00、24.00 μg/mL；洋川芎内酯Ⅰ的系列浓度分别为2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL。按照2.1项下色谱条件，分别进样，进样体积为20 μL，以混合对照品溶液的浓度为横坐标（X，μg/mL），峰面积（Y）为纵坐标，求得回归方程依次为=25 874X-223 420（r=0.999 4），=62 517X-24 495（r=0.999 4），=68 189X-11 573（r=0.999 6），=87 886X-26 232（r=0.999 4），结果表明芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ分别在19.38~310.00、1.51~24.16、1.50~24.00、2.00~32.00 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6.3 精密度考察

精密吸取同一混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ峰面积的RSD分别为0.76%、1.19%、1.10%、1.16%，结果表明该仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性考察

取按2.5项下方法制备的同一供试品溶液（四物汤合煎液），按照2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算RSD，结果芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ峰面积的RSD分别为0.88%、0.80%、1.17%、1.31%，表明该供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.5 重复性考察

取按2.5项下方法平行制备6份供试品溶液（四物汤合煎液），按照2.1项下色谱条件，测定峰面积，计算RSD，结果芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ峰面积的RSD分别为1.82%、0.76%、1.24%、0.97%，表明该方法的重复性良好。

2.6.6 加样回收率考察

取按2.5项下方法制备的已知成分含量的供试品溶液（四物汤合煎液），分别加入对照品适量（与样品中各待测成分的量相当），平行6份，按照2.1项下色谱条件进样分析，测定峰面积，计算加样回收率及RSD，结果芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ的平均加样回收率分别为95.89%、97.08%、96.84%、98.77%；RSD分别为2.90%、2.28%、2.87%、1.98%。

2.7 样品测定及结果

见图 2。取3个不同批次分别按2.5项下方法制备四物汤合煎液、单味药材单煎液，按照2.1项下色谱条件，分别进样20 μL，根据线性回归方程计算四物汤合煎液、单味药材单煎液（熟地黄9 g，当归9 g，白芍9 g，川芎9 g）中4种成分的溶出量。结果显示，四物汤合煎液中洋川芎内酯Ⅰ的溶出量低于当归、川芎药材溶出总量，而阿魏酸和藁本内酯的溶出量均高于当归、川芎药材溶出总量，芍药苷溶出量高于芍药药材溶出量。说明四物汤单味药在共同煎煮过程中存在化学成分的相互作用，增加了阿魏酸、藁本内酯和芍药苷的溶出或转化，而抑制了洋川芎内酯Ⅰ溶出或洋川芎内酯Ⅰ发生转化。见表 1。

3 讨论

《中国药典（2015年版）》中关于四物合剂的质量标准以芍药苷为含量评价指标，四物颗粒以芍药苷、阿魏酸为含量控制指标^[13]。同时研究发现芍药苷、阿魏酸为四物汤生血的主要功效成分^[14]。

本实验发现四物汤在共同煎煮过程中存在某些化学成分的相互作用，从而导致阿魏酸、藁本内酯和芍药苷的溶出或转化的增加，而洋川芎内酯Ⅰ溶出得到抑制或洋川芎内酯Ⅰ发生转化。进而说明合煎与单煎中化学成分的溶出量并不是组方药味的简单叠加，而有其内在的配伍规律，本研究结果从化学成分溶出量的角度为四物汤的配伍科学性提供了一定的参考及依据。

本实验发现单合煎中藁本内酯的溶出量变化较为显著，在合煎液中藁本内酯的溶出量趋近于当归、川芎单煎总溶出量的2倍，说明四物汤在合煎过程中有存在其溶出显著增加的影响因素，初步推测可能为当归-川芎药对之间相互作用的结果，也可能是与熟地黄、白芍配伍后对藁本内酯的溶出有促进作用。藁本内酯在四物汤单合煎溶出量变化的具体原因及其变化对药理活性的影响有待进一步研究。

四物汤中洋川芎内酯Ⅰ为苯酞类成分，化学结构不稳定，易发生氧化、水解、光解和异构化等反应^[15-17]。四物汤在回流提取过程中，受热能促进其转化，本实验发现四物汤在合煎液中洋川芎内酯Ⅰ的溶出量低于当归、川芎单煎液溶出总量，说明合煎过程中洋川芎内酯Ⅰ溶出得到抑制或洋川芎内酯Ⅰ发生转化。初步推测可能为配伍熟地黄、白芍后在高温提取过程中抑制了洋川芎内酯Ⅰ的溶出或促进了其转化。洋川芎内酯Ⅰ溶出量变化的具体原因仍需进一步研究。