血必净注射液由红花、丹参、赤芍、川芎、当归5味中药组成，是在中国著名传统方“血府逐瘀汤”基础上加减而成^[1]，丹参、红花活血止痛；赤芍清热凉血，散瘀止痛；当归养血活血；川芎行气活血，祛风止痛。功能主治为化瘀解毒，用于湿热类疾病。症见发热、喘促、心悸、烦燥等瘀毒互结症，适用于脓毒症和多器官功能障碍综合症^[2]，是国内外第一个明确用于脓毒症治疗的中药制剂。现代药理学研究已证实，血必净通过抗炎、抗内毒素^[3-4]对脓毒症和多器官功能障碍综合征（MODS）发病的多个层次、多个环节进行阻断，减少脓毒症和MODS的发生，降低病死率^[5]。体现了中药多成分、多途径、多靶点的特色和优势，为防治脓毒症和MODS提供了有效手段。大量临床研究表明，其防治脓毒症和MODS有效率达到85%以上。

现阶段对血必净注射液的研究多集中于作用机制和临床方面^[6-8]，药效物质基础方面报道甚少^[9-10]，其质量控制成分也仅限于红花黄色素A、芍药苷、原儿茶醛^[11]3种成分。文章建立简便、灵敏的UPLC-MS/MS的方法，对血必净注射液中的羟基红花黄色素A、原儿茶醛、原儿茶酸、迷迭香酸、咖啡酸、没食子酸、阿魏酸、绿原酸、丹参素、芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、鸟苷、尿苷进行含量测定，可用于血必净注射液的质量控制，以保障其临床用药的安全可靠。

1 仪器与材料 1.1 仪器

UPLC-TQ-S超高效液相色谱-质谱联用仪（美国Waters公司）；AX 205型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80 A型旋涡仪（上海沪西分析仪器厂）；Milli-Q超纯水机（Millipore公司）；3 K 15型高速离心机（美国Sigma公司）。

1.2 材料

对照品羟基红花黄色素A（批号MUST-12081605）、芍药苷（批号MUST-16041901）、芍药内酯苷（批号MUST-15091008）、氧化芍药苷（批号MUST-15033010）、苯甲酰芍药苷（批号MUST-15091010）、阿魏酸（批号MUST-15091605）、没食子酸（批号MUST-15042910）、丹参素（批号MUST-15082714）、绿原酸（批号MUST-15041814）和迷迭香酸（批号MUST-16040512）均购自成都曼斯特生物科技有限公司。咖啡酸（批号110885-200102）、原儿茶酸（批号110809-200604）和原儿茶醛（批号110810-201007）均购自中国食品药品检定研究院。鸟苷（批号XMM0662）和尿苷（批号XMM0664）购自天津士兰科技有限公司。血必净注射液购自天津红日药业股份有限公司。色谱纯乙腈购自美国Merck公司，色谱纯甲酸购自美国ROE公司。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC^® C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水；梯度洗脱，洗脱程序为：0~1 min，15%~15% A；1~3 min，15%~40% A；3~4 min，40%~70% A；4~5 min，70%~98% A；5~6 min，98%~98% A；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源，采用多重反应监测(MRM)模式进行负离子扫描，去溶剂氮气流速为900 L/h，去溶剂气温度为450 ℃，用于定量分析的离子对信息见表 1。

2.3 对照品溶液及供试品溶液的制备 2.3.1 对照品溶液的制备

分别精密称取羟基红花黄色素A、芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、阿魏酸、迷迭香酸和绿原酸对照品各5 mg，用甲醇溶解，配制为1 mg/mL的对照品储备溶液。分别精密称取咖啡酸、没食子酸、原儿茶醛、丹参素、尿苷、鸟苷和原儿茶酸5 mg，用50%甲醇溶解，配制为1 mg/mL的对照品储备溶液。储备液均于4 ℃冰箱储存备用。

2.3.2 供试品溶液的制备

血必净注射液用超纯水稀释300倍，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察 2.4.1 标准曲线、检测限、定量限

精确量取对照品储备液适量，用50%甲醇配制成含羟基红花黄色素A和芍药苷5 000 ng/mL；原儿茶酸和迷迭香酸100 ng/mL；咖啡酸、没食子、阿魏酸、原儿茶醛、绿原酸、丹参素、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、鸟苷和尿苷500 ng/mL的混合对照品溶液，将此溶液用50%甲醇依次稀释2.5、2、2、5、2倍得6个浓度的对照品混合溶液。取各个浓度上述溶液，进样5 μL分析。以各对照品峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X）为横坐标，得羟基红花黄色素A、原儿茶醛、原儿茶酸、迷迭香酸、咖啡酸、没食子酸、阿魏酸、绿原酸、丹参素、芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、鸟苷和尿苷的回归方程。将该混合对照品溶液逐步稀释，分别以S/N=3和S/N=10时各对照品的浓度作为最低检测限（LOD）和最低定量限（LOQ）。结果见表 2。

2.4.2 精密度实验

取按“2.4.1”项下稀释5倍混合对照品溶液，按上述的色谱及质谱条件连续进样6次，测得各对照品色谱峰峰面积，计算其RSD值，结果见表 3。结果表明该方法精密度良好。

2.4.3 重复性实验

按“2.3.2”项下制备供试品溶液6份，分别进样5 μL，记录15种成分峰面积，计算其RSD值，结果见表 4。结果表明该方法重复性较好。

2.4.4 稳定性实验

取按“2.3.2”项下制备供试品溶液，分别于0、2、4、8和12 h进样5 μL，记录15种成分色谱峰面积，考察样品室温放置稳定性，计算其RSD值，结果见表 5。结果表明，除没食子酸外，其他成分在12 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率实验

精密量取已知含量的血必净注射液6份，加入一定量混合对照品溶液，进样5 μL，计算加样回收率。结果见表 6。

2.5 样品测定

取10份不同批次的血必净样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按已建立的色谱及质谱条件下进行测定，计算15种成分的含量，结果见表 5。MRM图如图 1所示。

3 结果与讨论

实验采用ACQUITY UPLC ^®C₁₈柱（2.1 mm×100 mm, 1.7 μm）对样品进行梯度洗脱，各目标成分出峰时间短，6 min内完成出峰，且分离度较好。通过比较乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸水，乙腈-水（2 mmol/L乙酸铵），结果表明，乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，能够良好改善峰型。实验采用多反应监测（MRM）模式负离子监测，通过比较不同毛细管电压（2.5、2.8、3.0 kV），锥孔电压（20、28、30、35 V）和源电压（50、60、68 V），结果表明当毛细管电压为2.5 kV，锥孔电压30 V，源电压60 V时，化合物响应较好。

文章采用UPLC-MS/MS的方法对血必净注射液中15种成分同时进行定量分析。在12 h稳定性的考察中，没食子酸在4 h后含量逐渐减少，其余化合物在12 h内含量均稳定。实验同时对不同批次的血必净样品进行检测，结果表明10批血必净注射液样品中含量最高为芍药苷，平均浓度为1 107.91 μg/mL，其次为羟基红花黄色素A，平均浓度为730.42 μg/mL。氧化芍药苷、咖啡酸、没食子酸、阿魏酸、原儿茶醛、丹参素绿原酸、尿苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、鸟苷和迷迭香酸的平均浓度分别为44.54、6.33、14.55、30.25、6.49、6.48、5.37、64.19、27.55、18.13、66.44、11.34 μg/mL。含量最少的为原儿茶酸，平均浓度为0.86 μg/mL。文章所建立的UPLC-MS/MS检测方法可用于血必净注射液的质量控制。