达原饮出自明代医家吴有性的《温疫论》，由槟榔、厚朴、草果、知母、白芍、黄芩、甘草7味中药组成，具有开达膜原，辟秽化浊的功效，主治瘟疫或疟疾邪伏膜原之证^[1]。方中槟榔为君药，辛散湿邪；草果辛香化浊，厚朴芳香化浊，共为臣药；佐白芍、知母清热滋阴，佐黄芩清热燥湿；甘草为使药，既能清热解毒，又能调和诸药^[2]。从达原饮的现代临床应用看，其适应症十分广泛，然而都离不开共同的病机，即“膜原证”，常用于各种发热、盗汗、扁桃体炎、便秘、淋证、腹胀等多种疾病^[3-6]，疗效颇佳。目前达原饮质量控制方面的研究较少，有文献报道^[7]，针对达原饮相关制剂中1个或2个成分(如黄芩苷)进行含量测定来控制制剂质量。但中药复方中成分复杂，单一指标成分的含量测定难以较全面控制质量，有必要结合达原饮处方药味特点，建立多指标成分的含量控制方法。本实验采用高效液相色谱法(HPLC)在同一色谱条件下同时测定达原饮中芒果苷等6种活性成分含量的方法，旨在为达原饮制剂的开发提供一种更全面的质量控制方法。

1 仪器与材料 1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪(四元泵，VWD检测器，自动进样器，OpenLAB工作站，美国安捷伦公司)；Sorvall ST16R高速离心机(德国Thermo Scientific公司)；Milli-Q超纯水机(德国Millipore公司)；Mettler Toledo XP205电子分析天平(Mettler Toledo仪器有限公司)；FA 124型天平(上海舜宇恒平有限公司)。

1.2 试剂

黄芩苷(批号110715-201318)、芍药苷(批号110736-201438)、芒果苷(批号111607-200402)、甘草酸铵(批号110731-201418)、厚朴酚(批号110729-200412)、和厚朴酚(批号110730-201313)对照品由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙睛均为色谱纯，Fisher scientific公司；水为超纯水，磷酸为色谱纯，购于天津光复精细化工研究所。槟榔、厚朴、草果、知母、白芍、黄芩、甘草的药材信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为230 nm，柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)进行梯度洗脱，洗脱程序见表 2。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取芒果苷、芍药苷、黄芩苷、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加甲醇制成浓度分别为:158.20、336.82、1478.99、90.30、17.18、5.37 mg/L混合对照品储备液。分别精密量取0.5、1、2、4、5、6、10 mL储备液置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得系列混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

按处方称取上述7味药材置2 L的煎药壶中，加适量水，浸泡，加盖煎煮，滤除药渣，得滤液；精密量取滤液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，取适量12 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.3 系统适应性实验

分别精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液10 μL，按“2.1”项色谱条件进样，结果6种被测成分均能达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰计均超过10 000，峰形较好。HPLC色谱图见图 1。

2.4 线性关系考察

在“2.1”项色谱条件下，分别吸取系列质量浓度的混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别按照色谱条件依次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程。结果见表 3。

2.5 精密度

取混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，进样体积为10 μL，以对照品峰面积进行计算，芒果苷、芍药苷、黄芩苷、甘草酸、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.34%、1.89%、1.55%、0.70%、1.44%、1.64%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性

取供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，分别在0、2、4、8、16、24、36 h进样，测定芒果苷、芍药苷、黄芩苷、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积，按峰面积计算得RSD%分别为0.31%、0.83%、0.54%、1.79%、1.11%、1.79%，结果表明供试品溶液在室温条件下放置36 h稳定性良好。

2.7 重复性

取同一批达原饮煎液，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液6份，精密吸取溶液10 μL，按"2.1”项下色谱条件测定，分别测得芒果苷、芍药苷、黄芩苷、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚含量的RSD分别为0.22%、1.02%、0.36%、0.96%、0.32%、0.38%，结果表明方法重复性良好。

2.8 回收率

精密移取同一批达原饮药液2.5 mL，共9份，分别精密加入高、中、低3个水平的芒果苷、芍药苷、黄芩苷、甘草酸铵、厚朴酚、和厚朴酚对照品，每个水平3份，按"2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液并进样分析。结果芒果苷、芍药苷、黄芩苷、甘草酸、和厚朴酚、厚朴酚的平均回收率分别为102.2%、98.6%、100.7%、97.5%、99.3%、101.1%，RSD分别为1.83%、1.61%、1.68%、1.30%、1.67%、1.91%。

2.9 样品测定

分别称取处方量的上述7味药材置2 L的煎药壶中，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，平行6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并计算样品中6种指标成分的含量，结果见表 4。

结果表明，同一产地、同一批次的6份达原饮煎液中各个指标的含量存在一定的差异，分析可能与制备煎液的药味处方量少、药材饮片规格、大小不一等有关。

3 讨论

达原饮由槟榔、厚朴、草果、知母、白芍、黄芩、甘草7味药材组成，参照药典及文献^[8-16]，其主要指标性成分分别为槟榔碱、厚朴酚、和厚朴酚、芒果苷、知母皂苷BⅡ、芍药苷、黄芩苷、甘草酸。槟榔碱为小分子生物碱，在C18柱上几乎无保留^[17]，而知母皂苷BⅡ为紫外区末端吸收^[18-19]，由于紫外检测器的检测范围的有限性、常用C18柱的选择性都不足以同时对上述所有指标成分进行定量分析，因此采用广泛使用的反相高效液相色谱紫外法(HPLC-UV)选择其中6种主要活性成分进行含量测定。

分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脱作为流动相，发现乙腈-水、甲醇-水作为流动相时，芍药苷拖尾严重，而乙腈作有机相的分离效果更好，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作流动相，各峰的保留时间合适且拖尾现象有一定改善，进一步加大流动相中酸的含量，用0.2%磷酸代替0.1%磷酸，拖尾现象显著改善，提高了分析灵敏度，故选定其为流动相。

本实验根据扫描供试品溶液200~400 nm的二极管阵列检测器(DAD)的光谱谱图，确定几个较好的检测波长，分别为215、230、254、280、294 nm，采用HPLC进行单个波长测定，综合考虑色谱峰峰高和分离度，可知在波长230 nm下为最佳，最终确定最佳检测波长为230 nm。

厚朴作为方中臣药，其主要活性成分厚朴酚、和厚朴酚在达原饮中的含量较低，分析原因在于厚朴酚、和厚朴酚均为脂溶性成分^[20]，在水中的溶解度小，而达原饮煎液采用水作为溶剂提取，因此煎液中厚朴酚、和厚朴酚含量低。黄芩苷作为黄芩的主要活性成分，在达原饮中的含量高。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒的功效，在方中发挥着重要的作用。

本实验建立的HPLC方法可快速定量测定达原饮中的6种主要药效成分。本方法简单、灵敏、准确、精密度高，为达原饮的全面质量控制提供更为可靠的保证。