2018, Vol. 37文章信息
- 沈鑫, 张思泉, 张莹雯, 柯浩亮, 帅瑜
- SHEN Xin, ZHANG Siquan, ZHANG Yingwen, KE Haoliang, SHUAI Yu
- 当归补血汤对糖尿病肾病大鼠PERK通路的影响
- Effect of Danggui Buxue decoction on the expression of GRP78-PERK-eIF2α in diabetic nephropathy rats
- 天津中医药大学学报, 2018, 37(2): 131-136
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 37(2): 131-136
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2018.02.11
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文章历史
收稿日期: 2017-10-21
糖尿病肾病（DN）是糖尿病的一种严重并发症，是导致终末肾衰竭（ESRD）的主要原因之一[1]。近30年来，随着世界范围内糖尿病患者的增加，DN发病率也随之急剧提高[2]。DN发病机制复杂，涉及多种细胞因子和信号转导通路，包括糖代谢紊乱、氧化应激、血流动力学异常、细胞因子参与以及遗传因素等[3]。内质网应激（ERS）是近年来新发现的DN发病机制，被证实与DN关系密切[4-6]。本实验旨在探讨当归补血汤对DN大鼠GRP78-PERK-eIF2α通路的影响，为当归补血汤治疗DN提供新依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠60只，6~8周龄，体质量180~210 g，均购自武汉大学实验动物中心[许可证号：SCXK（鄂）2014-0004]。饲养于武汉大学实验动物中心标准饲养房，室温（22±2）℃，相对湿度60%，每日光照12 h，实验期间不限饮食和饮水，定期更换敷料，连续观察8周。
1.1.2 实验药物当归补血汤由当归、黄芪按1：1配比（前期实验提示此为治疗DN最优配比），药物饮片购自湖北省中药材公司，当归、黄芪生药饮片浸水1 h，煮沸40 min，过滤后的药渣再次加水煮沸，重复2次，合并煎煮液，在水浴中浓缩，置4 ℃冰箱备用，按实验需要再行旋转蒸发浓缩备用。
1.1.3 主要仪器和试剂超净工作台（苏净安泰），全自动生化分析仪（日本东芝公司），倒置光显微镜（Olympus日本），透射电子显微镜（日立公司），超薄切片机（瑞典Bromma公司），台式离心机（上海安亭科学仪器厂），PCR仪（杭州博日科技），电泳仪（北京市六一仪器厂），链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司，溶于0.1 mol/L，pH=4.3的柠檬酸钠缓冲液中）；RIPA总蛋白裂解液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒（ASPEN）等。
1.2 方法 1.2.1 饲养条件实验动物饲养于武汉大学实验动物中心标准饲养房，普通饲料和高脂饲料均由实验动物中心提供。室温20 ℃，相对湿度60%，每日光照12 h，实验前先适应性饲养1周，实验期间不限饮食和饮水，定期更换敷料，连续观察8周。
1.2.2 糖尿病大鼠的分组和造模大鼠适应性饲养1周后，随机选取10只为对照组（n＝10），喂普通饲料; 其余大鼠为造模组（n＝50）喂以高脂饲料，大鼠均不限饮食和饮水。1周后，将造模组大鼠禁食12 h，并给予一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg（溶于0.1 mmol/L，pH=4.3的柠檬酸钠缓冲液中），对照组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液（0.1 mmol/L，pH=4.3）一次性腹腔注射，注射48 h后采足底静脉血，连续3 d测随机血糖，血糖≥16.7 μmol/L视为糖尿病大鼠造模成功[7]。造模组成活且造模成功的大鼠共43只，随机选取40只纳入实验，随机分为模型组[n＝10，生理盐水10 mL/（kg·d）]，当归补血汤高剂量组[高剂量组，n＝10，7.14 g/（kg·d）当归补血汤溶缩液]，当归补血汤低剂量组[低剂量组，n＝10，1.79 g/（kg·d）当归补血汤溶缩液]，格列齐特组[n＝10，2.68 mg/（kg·d）格列齐特缓释片]，以上药物均通过灌胃方式给药，对照组（N组）给予生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃给药，连续灌胃8周后取材。
1.2.3 一般情况及生化指标的检测观察大鼠的精神、毛色、活动是否灵活、食量、饮水量、尿量等；实验第8周末，用代谢笼收集24 h尿液，记录尿量并于-80 ℃冰箱保存；所有大鼠禁食12 h，禁水8 h后，称量大鼠体质量，无菌条件下腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，腹主动脉采血，离心后取血清，全自动生化分析仪测大鼠空腹血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）；无菌条件下摘取双肾。
1.2.4 光镜及电镜下观察肾组织取小鼠肾组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，将组织切片按常规方法进行过碘酸雪夫氏染色（PAS）染色，于光镜200倍视野下观察肾脏组织结构变化。另取肾皮质剪碎用1.25%戊二醛固定，用透射电镜观察肾脏超微结构。
1.2.5 免疫组化检测GRP78、PERK、eIF2α蛋白的表达取小鼠肾组织于4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋，将石蜡切片脱蜡至水后用EDTA缓冲液中微波修复，置于3%过氧化氢溶液中孵育，甩干后以5% BSA封闭，依次加入稀释的一抗、相应种属的二抗于保湿盒中孵育，滴加配制DAB，显微镜控制显色，中性树胶封固后用显微镜观察拍照。
1.2.6 PCR检测大鼠肾组织中GRP78 mRNA、PERK mRNA、eIF2α mRNA的表达大鼠GRP78、PERK、eIF2α引物由Invitrogen Biotechnology Co., LTD.中国公司合成；总RNA的提取按试剂盒说明操作，用紫外分光光度计测量OD值并计算RNA浓度和质量；根据RNA的量，建立一个20 μL的反应体系，在RT-PCR仪器中进行逆转录反应：42 ℃ 30 min，80 ℃ 5 min，4 ℃冷却，-20 ℃保存，在PCR仪上扩增；目的基因扩增用ΔΔCT法计算，A=CT（目的基因，实验样本）-CT(内标基因，实验样本)，B=CT（目的基因，对照样本）-CT（内标基因，对照样本），K=A-B，表达倍数=2-K，采用β-actin为内参，计算GRP78、PERK、eIF2α的CT值。
1.2.7 Western blot法检测GRP78、PERK、eIF2α蛋白的表达每组随机选取两只大鼠的肾组织进行蛋白提取，检测蛋白浓度，保证每个样品总蛋白量。每个样品总蛋白上样量均为40 μg，进行制胶与上样，按浓缩胶80 V、分离胶120 V进行恒压电泳，按300 mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整，将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h，加入已稀释好的一抗4 ℃过夜（兔属GAPDH，GRP78与5%脱脂牛奶呈1：2 000，PERK与5%BSA呈1：1 000，eIF2α与5%BSA呈1：2 000）用TBST洗3次，每次5 min，加入稀释好的二抗（HRP-Goat anti Rabbit与5%脱脂牛奶呈1：10 000），室温孵育30 min，用TBST在室温摇床上洗4次，每次5 min，暗室中曝光，将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC 4.0软件处理系统分析目标带的光密度值。
1.2.8 统计学方法采用SPSS 20.0统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般情况对照组大鼠体毛光泽，活动敏捷，饮食量、尿量无明显变化，实验第8周末，体质量均较前增加；大鼠造模成功率为86%（43/50），造模成功后的大鼠体质量较对照组明显减轻，每日饮水量及尿量均多于对照组；造模后第4天可见大鼠皮毛湿黄，活动迟缓，多饮、多食、多尿、体质量下降，至实验第8周末，模型组大鼠上述症状最明显，治疗组上述情况得到不同程度改善，以高剂量组改善最为明显。
2.2 生化指标的检测与对照组相比，模型组大鼠血糖（GLU）、血脂（TG、TC）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及蛋白尿（MAU）均明显升高（P < 0.01）；与模型组相比，各治疗组的GLU、TG、TC、BUN、Scr及MAU均下降（P < 0.01或P < 0.05），3个治疗组中，格列齐特组的GLU下降最显著（P < 0.01），高剂量组BUN、Scr、MAU下降最明显（P < 0.01），肾功能改善明显。见表 1、表 2。
| mmol/L | ||||
| 组别 | n | GLU | TG | TC |
| 对照组 | 10 | 5.07±0.61 | 1.13±0.10 | 0.83±0.10 |
| 模型组 | 10 | 27.41±0.96## | 4.14±0.12## | 2.14±0.10## |
| 格列齐特组 | 10 | 9.92±0.52##** | 2.26±0.11##** | 1.27±0.10##** |
| 低剂量组 | 10 | 15.71±0.60##**△△ | 3.91±0.18##**△△ | 2.05±0.07##*△△ |
| 高剂量组 | 10 | 11.72±0.69##**△△ | 2.40±0.15##** | 1.35±0.08##** |
| 注：与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与格列齐特组比较，△△P < 0.01。 | ||||
| 组别 | n | BUN(mmol/L) | Scr(μmol/L) | MAU(mg/L) |
| 对照组 | 10 | 11.48±0.60 | 5.12±0.60 | 0.76±0.05 |
| 模型组 | 10 | 27.81±0.49## | 13.98±0.77## | 1.50±0.03## |
| 格列齐特组 | 10 | 18.77±0.45##** | 6.41±0.64##** | 1.31 ±0.03##** |
| 低剂量组 | 10 | 19.45±0.78##**△ | 8.27±0.57##**△△ | 1.26±0.03##**△ |
| 高剂量组 | 10 | 16.09±0.62##**△△ | 5.56±0.48#**△△ | 1.02±0.04##**△△ |
| 注：与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，**P < 0.01；与格列齐特组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01。 | ||||
对照组大鼠肾组织结构完整。模型组大鼠肾组织严重损伤，可见系膜细胞增生、基质增多，肾小球基底膜（GBM）增厚，PAS染色呈强阳性，部分肾小球可见毛细血管间出现PAS染色阳性的层状结节及节段性透明样变性，提示肾小球硬化，肾小管上皮肿胀，肾小管管腔变窄。格列齐特组和低剂量组可见轻度弥漫性系膜区细胞增生伴GBM增厚，肾小管无明显改变。高剂量组肾结构改善明显，仅见肾小球轻度水肿，无增生性病变，肾小管无明显改变。见图 1。
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| 图 1 各组大鼠肾组织PAS染色结果（×200） |
对照组GBM厚度基本均匀适中，足细胞位于GBM外层，足突结构完整，呈栅栏状整齐排列。模型组GBM增厚，足细胞出现空泡改变，裂隙膜减少，足突融合，部分足细胞从GBM脱落，排列紊乱；肾小管上皮细胞肿胀变性，可见内质网、线粒体和细胞核肿胀。格列齐特组和低剂量组病变减轻，GBM轻度增厚，系膜基质轻度增多。高剂量组病变改善明显。见图 2。
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| 图 2 各组大鼠肾组织电镜下观察结果(×2 000) |
GRP78、PERK、eIF2α在对照组中有少量表达，表现为棕黄色颗粒，三者主要定位在肾小管上皮细胞胞浆内; 模型组的GRP78、PERK、eIF2α表达较对照组明显增多，差异具有统计学意义（P < 0.01），三者主要定位于肾小管；高剂量组、低剂量组与格列齐特组的GRP78、PERK、eIF2α表达均明显低于模型组（P < 0.01），高剂量组相比于格列齐特组表达更低（P < 0.01或P < 0.05）。见表 3及图 3-5。
| 组别 | n | GRP78 | PERK | eIF2a |
| 对照组 | 10 | 3 989.66±259.44 | 1 834.63±116.73 | 1 683.58±78.94 |
| 模型组 | 10 | 19 703.39±1 524.04## | 12 787.18±1 883.59## | 20 566.95±1944.09## |
| 格列齐特组 | 10 | 7 238.58±487.35##** | 5 793.39±401.51##** | 5 605.04±465.45##** |
| 低剂量组 | 10 | 10 820.29±1 105.42##**△△ | 7 738.69±634.03##**△ | 11 707.93±1 340.87##**△△ |
| 高剂量组 | 10 | 5 284.77±313.01**△ | 3 383.93±249.95**△ | 2 250.02±58.41**△△ |
| 注：与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，**P < 0.01;与格列齐特组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01。 | ||||
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| 图 3 免疫组化检测GRP78蛋白表达结果(×200) |
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| 图 4 免疫组化检测PERK蛋白表达结果(×200) |
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| 图 5 免疫组化检测eIF2α蛋白表达结果(×200) |
GRP78、PERK、eIF2α在正常肾组织中有一定量的表达，相比于对照组，模型组大鼠GRP78、PERK、eIF2α的表达显著增高，差异具有统计学意义（P < 0.01）。相比于模型组，3个治疗组的GRP78、PERK、eIF2α的表达均降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）。相比于格列齐特组，高剂量组的GRP78、PERK、eIF2α的表达更低（P < 0.01或P < 0.05）。见表 4。
| 组别 | n | GRP78 | PERK | eIF2a |
| 对照组 | 10 | 0.96±0.05 | 0.97±0.09 | 0.97±0.10 |
| 模型组 | 10 | 4.50±0.13## | 3.11±0.08## | 3.02±0.24## |
| 格列齐特组 | 10 | 1.82±0.12##** | 1.80±0.10##** | 1.72±0.04##** |
| 低剂量组 | 10 | 3.05±0.08##**△△ | 2.32±0.10##**△△ | 2.39±0.07##**△△ |
| 高剂量组 | 10 | 1.49±0.04##**△△ | 1.48±0.04##**△△ | 1.40±0.04##**△ |
| 注：与对照组比较，##P < 0.01；与模型组比较，**P < 0.01；与格列齐特组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01。 | ||||
相比于对照组，模型组大鼠GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表达显著增高，差异具有统计学意义（P < 0.01）；相比于模型组，各治疗组的GRP78、PERK、eIF2α的表达均降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）；相比于格列齐特组，高剂量组的GRP78、PERK、eIF2α的表达更低（P < 0.01或P < 0.05），见表 5及图 6。
| 组别 | n | GRP78 | PERK | eIF2a |
| 对照组 | 10 | 0.07±0.01 | 0.04±0.02 | 0.04±0.01 |
| 模型组 | 10 | 0.84±0.10## | 0.47±0.05## | 0.66±0.07## |
| 格列齐特组 | 10 | 0.32±0.05##** | 0.20±0.03##** | 0.26±0.03##** |
| 低剂量组 | 10 | 0.51±0.02##**△△ | 0.32±0.06##**△△ | 0.38±0.01##**△△ |
| 高剂量组 | 10 | 0.18±0.02#**△△ | 0.12±0.03#**△ | 0.12±0.01#**△△ |
| 注：与对照组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；与模型组比较，**P < 0.01；与格列齐特组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01。 | ||||
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| 1：对照组；2：模型组；3：格列齐特组；4：低剂量组；5：高剂量组。 图 6 Western-blot电泳条带图 |
DN在中医学归为消渴病下消，基本病机为“气血两虚兼血瘀”。当归补血汤中黄芪味甘温，可益气固表，补气升阳；当归味甘辛温，可补血生血行血，两者配伍则阳生阴长，气旺血生，具有补气活血之功效，与其病机契合。现代研究发现，黄芪甲苷（Ⅳ）可通过下调PERK-ATF4-CHOP通路发挥抑制足细胞凋亡，保护肾组织，防治DN的作用[8]。且当归与黄芪配伍，当归可增强黄芪中黄芪甲苷在体内的活力，并可使黄芪甲苷达峰时间提前1倍[tmax由（4.00±1.54）h至（2.00±0.95）h]，达峰浓度提高1倍[Cmax由（60±7）μg/L到（146±27）μg/L]，加速黄芪甲苷发挥功效的进程[9]。当归补血汤可抑制高糖条件下肾小球细胞膜外基质蛋白表达[10]，下调多个靶器官相关蛋白因子（BMP-7、TGF、HPA等），具有预防和治疗早期DN的作用[11-13]。
本实验中，当归补血汤和格列齐特均可改善DN大鼠的一般情况，降低血糖、血脂，而且在降低尿蛋白，改善肾功能和肾脏结构损害方面，当归补血汤优于格列齐特。免疫组化、Western Blot及PCR显示模型组大鼠GRP78、PERK、eIF2α的表达明显高于对照组，表明ERS已经激活；当归补血汤治疗组大鼠肾组织中GRP78、PERK、eIF2α的表达相比于模型组明显下降，高剂量组下降更明显。实验表明当归补血汤可抑制PERK通路相关蛋白，缓解ERS，具有保护肾组织结构和肾功能作用，且呈浓度依赖性。
实验结果为临床治疗DN提供了新的依据。但仍存在问题需进一步探究，当归补血汤具体作用于PERK通路的机制尚不明确，推测当归补血汤可通过抑制PERK通路进一步抑制eIF2α下游的ATF4、CHOP、Capase12等凋亡相关基因缓解ERS造成的损害，是否激活了下游其他分子通路，还需更深入的研究。
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